[發(fā)明專(zhuān)利]F8蛋白變體及利用其制備的基因治療載體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110613444.2
• 申請(qǐng)日: 2021-06-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113336841B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程濤;張健萍;趙梅;殷夢(mèng)迪;李斯昂;楊智學(xué);張鳳;李國(guó)華;張孝兵
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所）
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/755
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/755;C12N15/12;C12N15/864;A61K48/00;A61K38/37;A61P7/04;G01N33/68
• 代理公司: 北京品源專(zhuān)利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供了F8蛋白變體及利用其制備的基因治療載體。所述F8蛋白變體為BDDF8?N6變體刪除至少4個(gè)氨基酸后得到的氨基酸序列中的任意一種；其中，刪除的氨基酸中包含弗林蛋白識(shí)別位點(diǎn)RHQR。本發(fā)明提供的F8蛋白變體，以BDDF8?N6變體為基礎(chǔ)，對(duì)B結(jié)構(gòu)域進(jìn)行優(yōu)化，刪除了F8蛋白弗林蛋白識(shí)別位點(diǎn)及其附近的氨基酸，得到了新的高效變體，所得變體載體滴度增加，體內(nèi)測(cè)試中F8的活性較高，具有較高的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種F8蛋白變體及利用其制備的基因治療載體，尤其涉及一種通過(guò)B結(jié)構(gòu)域優(yōu)化后得到的F8蛋白變體及其構(gòu)建的基因治療載體的開(kāi)發(fā)與利用。

背景技術(shù)

血友病A(HA)是凝血因子F8基因功能缺失引起的單基因遺傳性出血病性疾病，重癥有生命危險(xiǎn)。輸注F8蛋白是目前的主要治療方法，需要每周靜脈注射2-3次，生活質(zhì)量差，而且治療費(fèi)用昂貴。基因治療是根治血友病的唯一方法。

血友病A基因治療首選載體是AAV載體。AAV載體遞送F8的血友病A基因治療，經(jīng)過(guò)20多年的研究，已經(jīng)陸續(xù)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。其中，BioMarin(拜瑪林)公司開(kāi)發(fā)的valoctocogene roxaparvovec(BMN270，NCT02576795)基因療法處于領(lǐng)先地位，據(jù)報(bào)道接受了高劑量組(6×10¹³vg/kg)患者，F(xiàn)8活性維持在較高水平，病人的生活質(zhì)量明顯提高；然而，超高的給藥劑量所帶來(lái)的安全性問(wèn)題限制了相關(guān)藥物的使用。

目前，F(xiàn)8載體的優(yōu)化策略主要是對(duì)B結(jié)構(gòu)域的改造，從而促進(jìn)F8蛋白的表達(dá)和分泌，以及凝血功能。不斷優(yōu)化的變體包括：BDDF8-SQ變體、F8-N222變體、F8-N6變體、F8-RH變體和弗林蛋白識(shí)別位點(diǎn)不同程度刪除變體。其中，BDDF8(B domain-deleted F VIII)是指B結(jié)構(gòu)域刪除的F8。

(1)BDDF8-SQ變體：是將B結(jié)構(gòu)域中Ser743與Gln1638直接融合，形成了一段14aa(SFSQNPPVLKRHQR)序列，替代了B結(jié)構(gòu)域。這種變體的表達(dá)水平可以增加17倍，但是蛋白水平只提高了30％。

(2)BDDF8-N222變體：Pipe研究團(tuán)隊(duì)保留了B結(jié)構(gòu)域中6個(gè)天冬酰胺-連接的糖基化位點(diǎn)，形成了222aa序列替代B結(jié)構(gòu)域，可以明顯提高F8的表達(dá)。糖基化位點(diǎn)的保留可能通過(guò)促進(jìn)天冬酰胺鏈寡糖和LMAN1之間的結(jié)合，從而促進(jìn)蛋白的加工和裝運(yùn)，也可能減低了細(xì)胞內(nèi)不規(guī)則蛋白折疊反應(yīng)；這種變體在HA基因治療中應(yīng)用也比較廣泛。

(3)BDDF8-N6變體：由于AAV包裝容量的限制，繼續(xù)改造F8-N6蛋白，用包含6個(gè)天冬酰胺-連接的糖基化位點(diǎn)的18aa(SFSQNATNVSNNSNTSNDSNVSPPVLKRHQR)替代222aa，減少了AAV載體的包裝壓力。

(4)BDDF8-RH變體：研究發(fā)現(xiàn)犬BDDF8(Canine BDDF8，cBDDF8)的分泌形式主要是單體形式，而且激活狀態(tài)下比人BDDF8(human BDDF8,hBDDF8)更穩(wěn)定，通過(guò)比較兩者的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)氨基酸序列不同，弗林蛋白識(shí)別位點(diǎn)：cF8是1645-HHQR-1648，hF8是1645-RHQR-1648。將hF8中R替換成H：hF8-RH變體的蛋白表達(dá)水平2.5倍。

(5)弗林蛋白識(shí)別位點(diǎn)不同程度刪除變體：包括hF8-Δ1645、hF8-1645-46(Δ2)、hF8-1645-47(Δ3)、hF8-1645-48(Δ4)和hF8-Δ1648。這些變體，表達(dá)水平能提高2～4倍，并且提高F8蛋白的促凝功能。

除上述變體之外，開(kāi)發(fā)其他的能夠高水平表達(dá)的F8變體，得到高表達(dá)、高活性AAV-F8載體對(duì)于減少載體用量、提高AAV治療的安全性具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容