[發明專利]檢測對蝦VPAHPND急性菌株和亞急性菌株的方法

在審

• 申請號: 202110613088.4
• 申請日: 2021-06-02
• 公開（公告）號: CN113337626A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 沈輝;蔣葛;喬毅;萬夕和;成婕;范賢平;劉學實;李浩瀾;竇彥斌;王李寶;黎慧;史文軍
• 申請（專利權）人: 江蘇省海洋水產研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 張換君

本發明公開了檢測對蝦VPAHPND急性菌株和亞急性菌株的方法，屬于病原檢測技術領域。本發明針對VPAHPND毒力因子PirA和PirB設計引物，并利用該引物進行多重PCR擴增，并且引物具有特異性強和靈敏度高的特點；通過該引物構建的多重PCR方法操作簡單且便于實施，該方法能夠實現對于對蝦VPAHPND急性菌株和亞急性菌株的準確鑒別，利于對不同對蝦養殖場鑒別AHPND做出技術指導，以便于及時針對性的對AHPND進行防控和治療。

技術領域

本發明涉及病原檢測技術領域，涉及一種檢測對蝦VPAHPND急性菌株和亞急性菌株的方法。

背景技術

對蝦急性肝胰腺壞死綜合癥是近年來影響對蝦養殖最為嚴重的疾病之一。早期該病主要發生于對蝦苗期，統稱為早期死亡綜合癥(Early mortality syndrome，EMS)。該病的肝胰腺壞死癥狀與對蝦其它早期死亡癥狀存在明顯不同，因此，聯合國糧農組織和亞太地區水產養殖聯盟(NACA)將之命名為肝胰腺壞死綜合癥(Hepatopancreas necrosissyndrome，HPNS)或急性肝胰腺壞死綜合癥(Acute hepatopancreasnecrosis disease，AHPND)。

迄今為止，AHPND只發生于凡納濱對蝦、斑節對蝦和中國明對蝦。已有的研究顯示，在凡納濱對蝦蝦苗、幼蝦階段等都能檢測到病原的存在。但近幾年來，AHPND的發生季節不明顯，放苗60天后常有發生。高溫季節、放養密度高等對蝦發病率較高，養殖集中區域發病率較高，單養池塘的對蝦患病幾率和受影響程度均高于蝦魚混養池塘。

2013年5月1日全球水產養殖聯盟(GAA)宣布，亞利桑那大學研究團隊經過數月的調查研究發現了導致AHPND的病原體。美國萊特納教授領導的研究小組發表聲明：由未知因子引起的在中國和東南亞暴發的AHPND其病原已經被確定：一種副溶血弧菌(VPAHPND)。Sirikharin等純化VPAHPND的菌液上清用來感染健康對蝦，48h內引起健康對蝦極高的死亡率，SDS瓊脂糖凝膠電泳發現兩段分子量分別為12kDa和50kDa的蛋白PirA、PirB。Lee將接合缺少PirvpAB操縱子的pVA1-like質粒的VP菌株進行回歸感染實驗，結果未出現感染現象，進一步證明了PirA和PirB是AHPND發生的主要毒力因子的觀點。

PCR技術是分子生物學的基礎，自其問世以來，便應用于現代生物學的各個方面，且在常規PCR的基礎上，發展了其它PCR技術，如逆轉錄PCR(touch down)、降落PCR等等。多重PCR是一種特殊的PCR技術，它在同一反應體系中加入兩對及兩對以上的引物，可以同時檢測多個目的基因，產生多個目的條帶。多重PCR已成為鑒定病毒，細菌和寄生蟲的有效工具，目前雖然已經有針對AHPND進行多重PCR的方法報道，但是都是針對AHPND是否發生進行鑒定，而并沒有對引起AHPND的病原進行分型的檢測方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測對蝦VPAHPND急性菌株和亞急性菌株的方法，針對VPAHPND毒力因子PirA和PirB設計引物組合，采用多重PCR方法擴增PirA和PirB，實現對蝦VPAHPND急性菌株和亞急性菌株的準確鑒定，為不同地區對蝦養殖AHPND的控制提供技術指導。

為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

本發明提供了一種檢測VPAHPND急性菌株和亞急性菌株的引物，包括用于檢測VPAHPND毒力因子PirA和PirB的引物對，所述引物對為：

PirA-F：5’-CGTGGGGAGCTTACCATTCA-3’；

PirA-R：5’-AAACCACGACTAGCGCCATT-3’；

PirB-F：5’-AAACTTCGGTTATGCTGCGG-3；

PirB-R：5’-CACCAACTACGAGCACC CAT-3’。