[發(fā)明專利]一種幾丁二糖脫乙酰酶突變體及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110603957.5
• 申請日: 2021-05-31
• 公開（公告）號: CN113293155A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉龍;陳堅;盧健行;呂雪芹;盧偉;堵國成;李江華;張弘治;劉延峰;黃子洋
• 申請（專利權(quán)）人: 山東潤德生物科技有限公司;江南大學
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/55;C12N15/75;C12N1/21;C12P19/26;C12R1/125
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明涉及一種幾丁二糖脫乙酰酶突變體，由極端嗜熱古菌Pyrococcus horikoshii的幾丁二糖脫乙酰酶的第74位的甘氨酸G突變?yōu)楸彼酇得到。本發(fā)明提高了幾丁二糖脫乙酰酶Dac的酶活、表達量和催化效率，解決了幾丁二糖脫乙酰酶Dac轉(zhuǎn)化合成氨基葡萄糖GlcN效率不高的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種幾丁二糖脫乙酰酶突變體及應用。

背景技術(shù)

氨基葡萄糖GlcN又叫葡萄糖胺，是葡萄糖的一個羥基被氨基取代后的化合物，在醫(yī)療美容、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品保健等領(lǐng)域有著廣泛應用。作為形成軟骨組織細胞的重要營養(yǎng)素，氨基葡萄糖GlcN在許多國家已被列入醫(yī)藥品行列。幾丁二糖脫乙酰酶Dac在生產(chǎn)殼寡糖和單糖方面有著不容忽視的巨大潛力，市場上現(xiàn)存的脫乙酰酶，多是針對乙酰氨基葡萄糖的多聚體或寡聚體發(fā)揮作用，而針對單體形式發(fā)揮功能的脫乙酰酶鮮有報道。

幾丁二糖脫乙酰酶Dac來源于極端嗜熱古菌Pyrococcus horikoshii，具有良好的熱穩(wěn)定性和極強的耐熱性。劉波等(極端嗜熱古菌Pyrococcus horikoshii幾丁二糖脫乙酰酶的克隆、表達及性質(zhì)研究，微生物學報，2006(02)，255-258)指出幾丁二糖脫乙酰酶Dac不僅對幾丁二糖有活性，對乙酰氨基葡萄糖單體也有很高的催化活性，可以催化幾丁二糖的非還原性末端脫去乙酰基，從而生成非還原性末端部分脫乙酰化的GlcN-GlcNAc，然后在外切氨基糖苷酶的作用下生成氨基葡萄糖GlcN和N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc，隨后，幾丁二糖脫乙酰酶Dac再催化N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc脫乙酰生成氨基葡萄糖GlcN，相較于化學水解法和微生物催化法生產(chǎn)氨基葡萄糖GlcN，酶法催化具有原料來源豐富，且價格低廉，生產(chǎn)工藝簡單等優(yōu)點。

來源于熱球菌屬的幾丁二糖脫乙酰酶Dac可以利用N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc為底物進行單酶催化反應，實現(xiàn)氨基葡萄糖GlcN的一步生產(chǎn)。但利用幾丁二糖脫乙酰酶Dac轉(zhuǎn)化合成氨基葡萄糖GlcN效率不高，且酶的活性低，因此，酶的催化效率等酶學特性還有待進一步改進。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過丙氨酸掃描結(jié)合高通量篩選，提供了一種幾丁二糖脫乙酰酶Dac突變體，提高了幾丁二糖脫乙酰酶Dac的酶活、表達量和催化效率，從而解決了幾丁二糖脫乙酰酶Dac轉(zhuǎn)化合成氨基葡萄糖GlcN效率不高的問題。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種幾丁二糖脫乙酰酶突變體，由氨基酸序列如SEQID NO.3所示的幾丁二糖脫乙酰酶的第74位的甘氨酸G突變?yōu)楸彼酇得到。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種編碼幾丁二糖脫乙酰酶突變體的基因，含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種攜帶上述幾丁二糖脫乙酰酶突變體的載體。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種表達上述幾丁二糖脫乙酰酶突變體的細胞。

進一步地，細胞為枯草芽孢桿菌。

進一步地，枯草芽孢桿菌以B.subtilis WB600為宿主，以p43NMK為表達載體，表達上述幾丁二糖脫乙酰酶突變體。

本發(fā)明上述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：將極端嗜熱古菌編碼幾丁二糖脫乙酰酶的基因與p43NMK載體連接，得到重組表達載體p43NMK-Dac，以p43NMK-Dac為模板，通過PCR擴增的方法將特定序列突變后，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌進行篩選，得到重組枯草芽孢桿菌。

本發(fā)明利用丙氨酸體積小同時對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響較小的特性，將幾丁二糖脫乙酰酶Dac的關(guān)鍵氨基酸替換成丙氨酸，建立幾丁二糖脫乙酰酶Dac的丙氨酸掃描文庫，考察不同位點突變時，幾丁二糖脫乙酰酶Dac的酶活變化及某些功能的衰退情況，通過表達和篩選過程，從而鑒定某個氨基酸殘基在幾丁二糖脫乙酰酶Dac的功能和穩(wěn)定性等方面發(fā)揮的重要作用。