[發(fā)明專利]一種用于胰腺導(dǎo)管腺癌的早篩評估方法

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• 申請日: 2021-05-31
• 公開（公告）號: CN113373222A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 施巍煒
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州崛起醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12Q1/6869;G01N33/543;G01N33/574
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1.一種用于胰腺導(dǎo)管腺癌的早篩評估方法，其特征在于：包括以下操作步驟：

S1：選取100個早期胰腺導(dǎo)管腺癌（I或II期）人群和900名健康人群為試驗(yàn)檢測對象，抽取檢測對象的靜脈全血10毫升，采用離心方法，去掉血細(xì)胞，得到血清，如果對象離中心實(shí)驗(yàn)室離心處理有4個小時的間隔，可以采用含有乙二胺四乙酸（EDTA）的普通血液收集管收集，之后通過冰袋運(yùn)輸即可；

S2：取血清1毫升，平均分為3份，分別對三個蛋白，包括CA19-9、THBS2、MUC5AC，進(jìn)行用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法檢測，這里所用的抗體為商業(yè)化抗體，操作按照標(biāo)準(zhǔn)ELISA的方法進(jìn)行；

S3：剩余的大約4毫升血清，首先抽提CELL FREE DNA（即CF-DNA）；

S4：CF-DNA產(chǎn)物大約為50納克左右，其中的10納克進(jìn)行對KRAS基因的下一代測序（NGS）檢測突變檢測，用多重PCR的方法捕獲和富集7種常見的KRAS突變，捕獲和擴(kuò)增富集后的產(chǎn)物，按照ILLUMINA的測序文庫搭建方法建立文庫，在ILLUMINA測序儀（MYSEQ或NOVASEQ）上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的測序過程；

S5：另外的40納克對兩個甲基化位點(diǎn)進(jìn)行NGS的甲基化的檢測，首先用亞硫酸氫鹽處理對象DNA,甲基化的胞嘧啶堿基不變，而未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，隨后按照標(biāo)準(zhǔn)的測序方法進(jìn)行建庫，測序；

S6：根據(jù)機(jī)器學(xué)習(xí)模型的綜合打分，給出胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）的患病風(fēng)險得分，該得分的閾值根據(jù)數(shù)學(xué)統(tǒng)計模型得出，在閾值以上的是高危或患病人，建議積極的臨床檢測和隨訪。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于胰腺導(dǎo)管腺癌的早篩評估方法，其特征在于：所述S1步驟中的陽性樣本為早期胰腺導(dǎo)管腺癌（I或II期）人群，陰性樣本為健康人群。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于胰腺導(dǎo)管腺癌的早篩評估方法，其特征在于：所述S1步驟中的離心方法可以使用低速離心的方法，轉(zhuǎn)速可設(shè)置在4000轉(zhuǎn)/分鐘,離心時間設(shè)置5分鐘，溫度設(shè)置在4攝氏度。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于胰腺導(dǎo)管腺癌的早篩評估方法，其特征在于：所述S2步驟中的THBS2為血小板反應(yīng)蛋白2，所述MUC5AC為黏糖蛋白5AC。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于胰腺導(dǎo)管腺癌的早篩評估方法，其特征在于：所述S3步驟中的抽提是使用廣州吉賽生物cfDNA提取試劑盒，所述S3步驟中的CF-DNA產(chǎn)物大約為50納克左右，且其中的10納克進(jìn)行對KRAS基因的下一代測序（NGS）檢測突變檢測，另外的40納克對兩個甲基化位點(diǎn)進(jìn)行NGS的甲基化的檢測。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于胰腺導(dǎo)管腺癌的早篩評估方法，其特征在于：所述甲基化的檢測采用的方法是在亞硫酸氫鹽測序法（BSP）的標(biāo)準(zhǔn)流程上的修改。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于胰腺導(dǎo)管腺癌的早篩評估方法，其特征在于：所述S4步驟中的測序深度為1萬層。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于胰腺導(dǎo)管腺癌的早篩評估方法，其特征在于：所述S6步驟中機(jī)器學(xué)習(xí)模型采用的是隨機(jī)森林的方法，該方法的參數(shù)使用默認(rèn)參數(shù)。