[發明專利]一種發熱伴血小板減少綜合征病毒株的分離方法

在審

• 申請號: 202110603537.7
• 申請日: 2021-05-31
• 公開（公告）號: CN113337477A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 李家斌;殷俊;溫萌;胡立芬;葉英;劉艷艷;程君;陳振;柳燕;馬雪嬌;卞婷婷
• 申請（專利權）人: 李家斌
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 合肥銘輝知識產權代理事務所(普通合伙) 34212
• 代理人: 張立榮

本發明屬于醫學微生物學技術領域，尤其是一種發熱伴血小板減少綜合征病毒株的分離方法，解決了現有技術中發熱伴血小板減少綜合征病毒株分離比較困難，分離得到的菌株純度低，在細胞中培養比較困難，目前尚未有分離發熱伴血小板減少綜合征病毒的最佳方案的問題，所述發熱伴血小板減少綜合征病毒株的分離方法，包括以下步驟：將發熱伴血小板減少綜合征病毒感染Vero細胞，培養后收集細胞培養物上清液；過濾、加蔗糖墊層離心，取離心沉淀物即得。本發明分離方法簡便易操作，且耗時較短，其分離得到的發熱伴血小板減少綜合征病毒株純度較高，可用于后續發熱伴血小板減少綜合征的致病機制及特異性臨床表現的研究，意義深遠。

技術領域

本發明涉及醫學微生物學技術領域，尤其涉及一種發熱伴血小板減少綜合征病毒株的分離方法。

背景技術

發熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是一種急性傳染性疾病，由布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopeniasyndrome bunyavirus,SFTSV)感染所致，該新病毒隸屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，2009年在中國首次被發現，近年來已在大半個中國地區流行傳播，致數千人患病甚至死亡，平均病死率約10％，陸續地在韓國、日本和美國也有類似疫情報道。該疾病主要臨床癥狀表現為高熱、厭食、肌肉痛、寒戰、淋巴結腫大、白細胞降低、血小板減少和多器官功能衰竭等，少數患者病情較重且發展迅速，可因多臟器功能衰竭而死亡。截至2011年底的監測和調查結果顯示，病例多發生于4～10月份，以青壯年居多。潛伏期尚不十分明確，可能為1周～2周。急性起病，主要臨床表現為發熱，體溫多在38℃以上，重者持續高熱，可達40℃以上，部分病例熱程可長達10天以上。伴乏力、明顯納差、惡心、嘔吐等，部分病例有頭痛、肌肉酸痛、腹瀉等。查體常有頸部及腹股溝等淺表淋巴結腫大伴壓痛、上腹部壓痛及相對緩脈。少數病例病情危重，出現意識障礙、皮膚瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、彌漫性血管內凝血(DIC)等多臟器功能衰竭死亡。

發熱伴血小板減少綜合征病毒株是用于研究、分析、明確發熱伴血小板減少綜合征的致病機制及特異性臨床表現的重要部分。因此，進行發熱伴血小板減少綜合征病毒的快速分離，從而進行后續的疾病機制及檢測方法預防方法的研究至關重要。然而，現有技術中，發熱伴血小板減少綜合征病毒株分離比較困難，分離得到的菌株純度低，在細胞中培養比較困難。目前尚未有分離發熱伴血小板減少綜合征病毒的最佳方案。基于上述陳述，本發明提出了一種發熱伴血小板減少綜合征病毒株的分離方法。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術中發熱伴血小板減少綜合征病毒株分離比較困難，分離得到的菌株純度低，在細胞中培養比較困難，目前尚未有分離發熱伴血小板減少綜合征病毒的最佳方案的問題，而提出的一種發熱伴血小板減少綜合征病毒株的分離方法。

一種發熱伴血小板減少綜合征病毒株的分離方法，包括以下步驟：

(1)將發熱伴血小板減少綜合征病毒感染Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)，培養5-7天，待超過60％的細胞出現細胞病變效應后，收集細胞培養物上清液；

(2)使用0.22μm濾頭于生物安全柜中過濾步驟(1)中收集的細胞培養物上清液；

(3)準備超速離心管，在超速離心管底部加入8ml的濃度為20％的蔗糖溶液，形成蔗糖墊層；

(4)沿著步驟(3)中的超速離心管管壁，在蔗糖墊層上慢慢加入步驟(2)中過濾得到的細胞培養物上清液30ml；

(5)將步驟(4)中的超速離心管在4℃的溫度下離心，設置離心速度為40000g，離心時間為4h；

(6)離心結束后，倒置超速離心管，待試管內液體流干，棄掉離心后的上清液及蔗糖墊層，保留超速離心管底部的沉淀物，即得純化的發熱伴血小板減少綜合征病毒株。