[發明專利]一種用于瞬時驗證山楂基因功能的方法

在審

• 申請號: 202110602916.4
• 申請日: 2021-05-31
• 公開（公告）號: CN113322273A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 侯亞莉;董文軒;趙玉輝;張梟;王碧君;楊淮策
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/53
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于瞬時驗證山楂基因功能的方法，具體包括構建CpPDS?TRV2重組質粒，轉化農桿菌，將TRV1和CpPDS?TRV2重組質粒的農桿菌菌液混合后注射在山楂果實的赤道處，注射量為90?110μl。本發明通過將重組質粒注射入山楂果實赤道處構建了山楂果實的瞬時轉化體系，不需要遺傳轉化操作，又可以直接在果實上驗證，是驗證果實表達相關基因功能的較為理想的方法。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于瞬時驗證山楂基因功能的方法。

背景技術

研究基因的功能具有重要的意義。然而，多數果樹的穩定轉化較為困難，如果涉及果實的表型，耗時估計數年之久，山楂即是如此。因此，果樹上基因功能的驗證仍需要在模式植物擬南芥、煙草或者番茄‘Mico-Tom’中進行異源穩定過表達。穩定表達系統是指載體進入宿主細胞并經選擇培養，載體DNA穩定存在于細胞內，可隨細胞轉錄表達和傳代，目的蛋白的表達持久、穩定。缺點是由于需抗性選擇甚至加壓擴增等步驟，穩定表達相對耗時耗力。

然而在擬南芥和煙草上的異源穩定過表達并不能觀測到果實上的表型，而在番茄上的異源穩定過表達雖然能觀測果實表型，但是拿到T3代純合子花費的時間較長，并且由于植株的復雜性和異源性，并不能準確的體現基因的功能。瞬時表達系統是指宿主細胞在導入表達載體后不經選擇培養，載體DNA隨細胞分裂而丟失，目的蛋白的表達時限短暫。瞬時表達系統的優點是簡捷，實驗周期短。目前，沒有發現適用于山楂果實表達相關基因功能的驗證方法。

發明內容

本發明提供的一種用于瞬時驗證山楂基因功能的方法，通過將重組質粒注射入山楂果實赤道處構建了山楂果實的瞬時轉化體系，不需要遺傳轉化操作，又可以直接在果實上驗證，是驗證果實表達相關基因功能的較為理想的方法。

本發明提供一種用于瞬時驗證山楂基因功能的方法，包括如下步驟：

S1，擴增標記基因山楂CpPDS片段，將其連接至TRV2載體上，獲得CpPDS-TRV2重組質粒；

S2，將TRV1載體和CpPDS-TRV2重組質粒轉化農桿菌；

S3，將S2中鑒定為陽性的菌搖培至OD₆₀₀值為0.8-1.2；

S4，將S3中獲得的含有TRV1和CpPDS-TRV2重組質粒的農桿菌菌液按照體積比0.9-1.1：1混勻；

S5，在山楂盛花后120天進行注射，注射部位為果實赤道處，注射量為90-110μl。

進一步地，S3中，陽性的菌搖培至OD₆₀₀值為1.0。

進一步地，S4中，將含有TRV1和CpPDS-TRV2重組質粒的農桿菌菌液按照體積比1：1混勻。

進一步地，S5中，所述注射量為100μl。

進一步地，S2中，所述農桿菌為農桿菌GV3101。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

1、本發明建立了山楂果實的瞬時轉化體系，該體系的建立，為山楂基因功能分析和相關的轉錄調控、蛋白互作等分子生物學的研究，提供了良好的技術支撐。

2、本發明中利用病毒誘導的基因沉默(VIGS)既不需要遺傳轉化操作,又可以直接在果實上驗證，是驗證果實表達相關基因功能的較為理想的方法。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。