[發(fā)明專利]一種微液滴生物傳感器的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2021-05-31
• 公開（公告）號: CN113337573A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉龍;陳堅;呂雪芹;堵國成;李江華;劉延峰;孫國運
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;G01N21/64
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明涉及一種微液滴生物傳感器，微液滴中含有產(chǎn)酶菌、檢測菌和底物，檢測菌采用注射方式注射入培養(yǎng)后的含有產(chǎn)酶菌的微液滴中，保證檢測菌與產(chǎn)酶菌的濃度相當(dāng)且相對穩(wěn)定，其中，檢測菌可以且只可以利用氨基葡萄糖，激活生產(chǎn)熒光蛋白，從而根據(jù)微液滴中的熒光強度對氨基葡萄糖的濃度進(jìn)行檢測。本方法可用于液滴高通量篩選，可以極大的提升對產(chǎn)酶菌株的改造和對酶定向進(jìn)化的效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高通量檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種微液滴生物傳感器的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

氨基葡萄糖是一種廣泛存在于自然界的小分子單糖，在醫(yī)藥和保健品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前，工業(yè)上生產(chǎn)氨基葡萄糖主要采用化學(xué)水解法，此方法以蝦蟹殼中的甲殼素為底物，使用強酸進(jìn)行水解，反應(yīng)條件苛刻、易造成環(huán)境污染且生產(chǎn)效率有限。隨著綠色化學(xué)、環(huán)保制造的提倡，更多的研究開始關(guān)注綠色環(huán)保的微生物發(fā)酵技術(shù)，并以甲殼素、葡萄糖等廉價產(chǎn)品為底物，通過水解或合成等方式生產(chǎn)氨基葡萄糖。其中，己丁二糖脫乙酰酶可以將相對廉價的N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰水解，得到氨基葡萄糖。

然而，現(xiàn)有的通過微生物胞外表達(dá)己丁二糖脫乙酰酶仍然存在表達(dá)量有限的問題；同時，己丁二糖脫乙酰酶自身的催化活性也需要提升。針對這兩方面的問題，我們需要對表達(dá)己丁二糖脫乙酰酶重組菌株進(jìn)行工程改造，以及對酶本身進(jìn)行定向進(jìn)化。然而，這兩種改造方式往往會涉及到對上萬乃至百萬數(shù)量的突變進(jìn)行篩選，挑選出具有更高氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組菌株或者酶突變體。傳統(tǒng)的基于96孔板的檢測方法由于通量過低、試劑消耗量大等缺陷，已難以滿足篩選的需求。

現(xiàn)有的高通量篩選方法主要有流式細(xì)胞篩選和液滴微流體篩選。在流式細(xì)胞篩選中，所有細(xì)胞處于共同的培養(yǎng)環(huán)境，無法區(qū)分來自不同細(xì)胞的胞外分泌物，因而不適用于檢測氨基葡萄糖。而液滴微流體篩選通過制作液滴，在包裹細(xì)菌的同時提供了化學(xué)屏障，阻礙不同液滴間的化學(xué)交流，非常適合檢測酶法生產(chǎn)氨基葡萄糖的產(chǎn)量并進(jìn)行篩選，其篩選速度可以達(dá)到每秒數(shù)千液滴，遠(yuǎn)超于傳統(tǒng)的96孔板實驗。馬富強(微液滴酶反應(yīng)器超高通量篩選體系的建立，上海交通大學(xué)，2016)提出一種基于微流控芯片的“水-油”微反應(yīng)器雙色熒光分選體系，但采用直接將產(chǎn)酶菌和檢測菌包入液滴培養(yǎng)并檢測熒光的方法難以保證比例，且檢測菌可能影響產(chǎn)酶菌的生長。因此，仍需一種篩選通量高，可對大量突變和改造樣本進(jìn)行檢測分析的方法。目前還沒有研究報道可在液滴中有效檢測氨基葡萄糖的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明針對產(chǎn)酶菌株的工程改造和酶的定向進(jìn)化過程中出現(xiàn)的大量突變體，提供一種適用于微液滴高通量篩選的生物傳感器，實現(xiàn)對微液滴中氨基葡萄糖產(chǎn)量的檢測，從而解決現(xiàn)有對氨基葡萄糖檢測方法無法適用于液滴高通量篩選的問題。

本發(fā)明的一種微液滴生物傳感器的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)將產(chǎn)酶菌培養(yǎng)并稀釋至濃度為3-10百萬個菌/mL，將稀釋后的產(chǎn)酶菌包裹進(jìn)微液滴中，培養(yǎng)，得到含有產(chǎn)酶菌的微液滴，其中，產(chǎn)酶菌為可表達(dá)己丁二糖脫乙酰酶的菌株；

(2)向檢測菌培養(yǎng)液中加入N-乙酰氨基葡萄糖，得到檢測菌溶液，其中，檢測菌為只可以利用氨基葡萄糖激活生產(chǎn)熒光蛋白的菌株；

(3)將步驟(2)的檢測菌溶液注射入步驟(1)的含有產(chǎn)酶菌的微液滴中培養(yǎng)，得到微液滴生物傳感器，其中，按照單個微液滴中檢測菌和產(chǎn)酶菌的數(shù)量比為1:0.8-1.2注射檢測菌。

本發(fā)明包裹產(chǎn)酶菌時采用平均10個微液滴僅有1個包有單菌的策略，保證單細(xì)胞包裹率，避免多細(xì)胞包裹。同時采用注射法注射檢測菌，注射時，液滴流速和注射的水相(含有檢測菌、底物、IPTG誘導(dǎo)劑、培養(yǎng)基等)流速比約為1：0.8(由于液滴包含滴液內(nèi)的的水和液滴外的油，此比例下水相混合比約為1：1)，可控制檢測菌注射入微液滴的數(shù)量，培養(yǎng)過后的產(chǎn)酶菌與之有相近的細(xì)胞濃度，以此保證微液滴中產(chǎn)酶菌和檢測菌的數(shù)量比約為1:1且相對穩(wěn)定。微液滴生物傳感器將產(chǎn)酶菌與檢測菌共培養(yǎng)，再加入底物進(jìn)行氨基葡萄糖濃度的檢測。