[發明專利]一種Cap2結構5′帽子類似物及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110600577.6
• 申請日: 2020-08-20
• 公開（公告）號: CN113201566A
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 胡勇;張苗苗;洪丹;胡迅
• 申請（專利權）人: 深圳市瑞吉生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C07H21/02
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 張夢澤

本發明提供了一種Cap2結構5'帽子類似物及其制備方法和應用，屬于基因工程技術領域，所述Cap2結構5'帽子類似物的分子式為：m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeA)。本發明提供的Cap2結構5'帽子類似物具有更高的合成效率、更高的加帽效率、更低的免疫原性和更高的蛋白翻譯效率。

本申請是申請日為2020年08月20日、申請號為202010842263.2、發明名稱為《一種Cap2結構5′帽子類似物及其制備方法》的分案申請，申請人為深圳市瑞吉生物科技有限公司。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種Cap2結構5′帽子類似物及其制備方法和應用。

背景技術

翻譯效率和免疫原性是mRNA藥物行使功能的兩大關鍵因素。自體免疫蛋白如RIG-I和IFIT識別異常加帽的mRNA，降低了外源mRNA在細胞內的活性和半衰期，使得mRNA藥物在體內難以發揮作用。因此，優化mRNA帽結構對于提高mRNA的生物活性和降低免疫原性是至關重要的。

目前在體外合成帶帽的mRNA有兩種方法，第一種是mRNA轉錄后使用牛痘病毒加帽酶對其進行加帽，產生帶Cap0或Cap1的RNA，這種加帽方法很高效，但是產量不穩定，價格也很昂貴。此外酶促加帽法不能產生Cap2和m6Am的帽子。第二種方法是轉錄過程中加入過量的帽結構類似物來進行加帽。截至目前，最常用的帽結構類似物是ARCA，使用ARCA可產生具有免疫原性的Cap0，但是加帽效率只有70％。該方法的產量也比較低，每毫升轉錄反應體系最多制備1.5mgRNA，轉錄產物具有很高的免疫原性。另一種叫做Cleancap的共轉錄加帽的方法也被廣泛采用。Cleancap屬于Cap1，與ARCA使用二聚體(m7GpppG)啟動T7轉錄不同，CleanCap使用三聚體(m7GpppAmG)啟動T7轉錄。該方法的產量比較高，每毫升轉錄反應體系制備4mg加帽的RNA，加帽效率可達90％，其轉錄產物的免疫原性低于ARCA。

基于現有mRNA合成體系中的帽結構類似物的加帽率低，單位合成體積內mRNA產量低以及免疫原性高等缺點，從而研發了Cap2帽結構類似物，既彌補了以上應用上的缺點，又大大提升了蛋白翻譯效率。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種Cap2結構5′帽子類似物及其制備方法和應用，本發明提供的Cap2結構5′帽子類似物具有更高的合成效率、更高的加帽效率、更低的免疫原性和更高的蛋白翻譯效率。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

本發明提供了一種Cap2結構5′帽子類似物，所述Cap2結構5′帽子類似物的分子式為：m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeA)。

本發明還提供了上述方案所述的Cap2結構5′帽子類似物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將2′-O-Methyl-UTP溶解在無RNA酶水中，再與磷酸水解酶、2×ReactionBuffer混合后進行孵育，得到2′-O-Methyl-UDP；

2)將所述步驟1)得到的2′-O-Methyl-UDP溶解在無RNA酶水中，再與7-Methylguanosine、鳥苷轉移酶、2×Reaction Buffer混合后進行孵育，得到m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)；

3)將所述步驟2)得到的m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)溶解在無RNA酶水中，與T4RNALigase1混合后，再與2′-O-Methyl-ATP混合，再與2×T4 RNA Ligase ReactionBuffer混合后進行孵育，得到Cap2結構5′帽子類似物。

優選的，所述步驟1)中2′-O-Methyl-UTP的物質的量與無RNA酶水的體積比為1～30mmol:14μL。