[發明專利]一種無菌菠蘿外植體制備方法及其農桿菌轉化方法

在審

• 申請號: 202110599212.6
• 申請日: 2021-05-31
• 公開（公告）號: CN113512523A
• 公開（公告）日: 2021-10-19
• 發明（設計）人: 岳晶晶;賈海鳳;明瑞光
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/22
• 代理公司: 廈門智慧呈睿知識產權代理事務所(普通合伙) 35222
• 代理人: 楊唯

本發明提供了一種無菌菠蘿外植體制備方法及其農桿菌轉化方法，無菌菠蘿外植體制備方法包括將菠蘿幼嫩植株先用清水沖洗干凈，然后通過75％的酒精和0.1％HgCl₂分別進行消毒后，通過菠蘿不定芽誘導培養基誘導菠蘿不定芽的產生，產生的不定芽轉移至不定芽擴繁培養基上繼續光照培養，得到無菌菠蘿植株，無菌菠蘿植株轉移至壯苗培養基上繼續光照培養，得到較為粗壯的無菌菠蘿植株，將其切成約3mm左右厚度的莖圓片，可以用于菠蘿農桿菌轉化。該方法通過優化外植體消毒方法得到無菌植株，通過不定芽途徑得到大量菠蘿莖圓片，并在莖圓片的基礎上進行菠蘿的轉化，提高了菠蘿的轉化效率；該方法所需設備簡單、操作技術容易掌握，具有廣闊的開發應用前景。

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種無菌菠蘿外植體制備方法及其農桿菌轉化方法。

背景技術

菠蘿(Ananas comosus)，是熱帶和亞熱帶第三重要的水果作物，僅次于香蕉和柑橘。菠蘿原產于南美洲巴西、巴拉圭的亞馬遜河流域一帶，16世紀從巴西傳入中國。現在已經流傳到整個熱帶地區。菠蘿作為鮮食，甜酸適口，清脆多汁。菠蘿除鮮食外，多用以制罐頭，因其能保持原來風味而受到廣泛喜愛。加工制品菠蘿罐頭被譽為“國際性果品罐頭”，還可制成多種加工制品，廣受大眾歡迎。葉的纖維較為堅韌，可供用于織物、制繩、結網和造紙。

雖然通過自交不親和單子葉植物物種雜交已經廣泛的用于生產改良植物品種，但是高水平基因組雜合性與基因組不穩定性，導致用這種方法改良植物品種是很難的。通過轉基因技術進行改良植物品種對解決各種農業、農藝問題有著巨大的潛力。轉基因抗除草劑菠蘿、解決早熟開花轉基因菠蘿等菠蘿轉化的成功，證明通過植物基因工程技術是可行而且高效的，因此找到一種穩定高效的用于菠蘿轉基因的方法，對菠蘿新品種開發和基因功能的研究有非常重要的意義。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種實施可靠、制備便利的無菌菠蘿外植體制備方法以及簡便、高效的農桿菌轉化方法，

為了實現上述的技術目的，本發明所采用的技術方案為：

一種無菌菠蘿外植體的制備方法，包括：將菠蘿植株消毒后切塊，并放在菠蘿不定芽誘導培養基上進行不定芽的誘導，得到的不定芽繼續培養成無菌菠蘿植株，從無菌菠蘿植株基部切下莖圓片，作為無菌菠蘿外植體。

進一步的，所述菠蘿植株為幼嫩的菠蘿植株；將其沖洗干凈后在無菌環境中對其進行消毒處理。

進一步的，所述菠蘿植株的消毒處理步驟包括：先用75％的酒精消毒30秒，無菌水清洗3～5次，再用0.1％的HgCl₂消毒6-8min，無菌水清洗5次以上，每次清洗時間大于1min。

進一步的，經消毒處理后的菠蘿植株用無菌濾紙吸干水分，并將消毒好的菠蘿植株切成0.4～0.8cm的塊狀，放置在菠蘿不定芽誘導培養基3B0.2N上，26℃溫度條件下，光照培養20～30天，獲得菠蘿不定芽。

進一步的，將得到的不定芽轉移至MS液體培養基培養基上，26℃溫度條件下，光照繼續培養20～30天，獲得無菌菠蘿幼株；將菠蘿幼株繼續轉移至液體PM培養基上，26℃溫度條件下，光照繼續培養14天，獲得無菌菠蘿植株。

進一步的，在超凈臺中從基部開始橫切2-4mm厚度的莖圓片2-3片，作為無菌菠蘿外植體。

進一步的，所述菠蘿不定芽誘導培養基3B0.2N包括如下質量濃度的組分：

MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝膠3g/L，6-BA 3mg/L，NAA 0.2mg/L；其pH為5.6-5.8。

其中，菠蘿愈傷組織誘導培養基3B0.2N的成分混合方案之一如下：將含有MS4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝膠3g/L，pH 5.6-5.8之間的混合液經高壓滅菌后加入6-BA3mg/L，NAA 0.2mg/L。