[發明專利]靶向沉默辣椒疫霉纖維素合酶3的植物表達載體及其應用

在審

• 申請號: 202110596400.3
• 申請日: 2021-05-30
• 公開（公告）號: CN113151281A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 劉西莉;王治文;鐘珊;高翔;李瑜;張博瑞;張思聰;李騰蛟
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京惟誠致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 11536
• 代理人: 王慧鳳

本發明公開了可通過寄主誘導的基因沉默有效干擾辣椒疫霉纖維素合酶3基因的植物表達載體及其應用。本發明的植物表達載體可以轉錄形成具有反向互補結構的雙鏈RNA，由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核酸序列分別以正、反向兩次插入載體構成。本發明還公開了這些表達載體在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的應用。表達本發明涉及的載體的植物對辣椒疫霉的抗病性明顯增強，侵染這些植物的辣椒疫霉的纖維素合酶3基因表達受到了顯著抑制，由于纖維素合酶3基因對于辣椒疫霉的發育和致病是必需的，因此本專利涉及的植物表達載體可有效抑制辣椒疫霉對植物的侵染，為防治辣椒疫霉引起的相關病害提供了一種有效途徑。

技術領域

本發明涉及農業生物技術領域，具體涉及兩種具有不同二級結構轉錄本的抑制辣椒疫霉纖維素合酶3基因表達的植物表達載體，以及這些植物表達載體在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的應用。

背景技術

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一種重要植物病原卵菌，在世界各地均有分布，可侵染茄科、豆科及大多數葫蘆科的70多種植物，引起猝倒、萎蔫和根、莖、果實腐爛，從苗期至果期均能發病，造成嚴重的經濟損失。辣椒疫霉引起的辣椒疫病是一種毀滅性病害，可經雨水、土壤和氣流等途徑傳播，造成葉片枯萎、果實腐爛，甚至全株枯死等癥狀，對作物產量、品質影響極大，嚴重時可導致減產50％以上。

對辣椒疫霉的防治主要依賴于化學防治，但由于殺卵菌劑的種類較少，長期單一使用化學農藥已導致辣椒疫霉對多種化學農藥產生抗藥性，且不斷增大劑量施用化學農藥對于環境造成嚴重污染。此外，對辣椒疫霉具有抗性的植物品種資源匱乏，亟需開發新型手段防治辣椒疫霉引起的植物病害。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，其可以通過阻礙特定基因的轉錄或翻譯來抑制基因表達。RNAi在生物體內普遍存在，DNA轉錄形成的雙鏈或發卡結構的RNA序列可以被加工為20-30bp之間的小RNA，這些小RNA通過介導基因沉默復合體特異識別與之互補配對的靶基因DNA或mRNA序列，造成mRNA的切割、翻譯抑制或DNA甲基化，最終抑制基因的正常表達(Fire,A.等.1998.Nature.391(6669)：806)。寄主誘導的基因沉默技術(Host-induced gene silencing,HIGS)是基于RNAi的原理，在寄主植物中表達靶向病原物關鍵基因的沉默載體即HIGS介體，當病原物入侵寄主植物時，由HIGS介體剪切加工生成的小RNA在轉錄后水平沉默病原菌重要基因，從而保護植物免受侵染，提高植物對病原物的抗性。HIGS因其不依賴抗性品種資源而成為理想的植物病害防治策略(Koch,A.等.2014.Plant biotechnology journal.12：821-831)，已在部分植物-病原菌的互作系統中被成功應用。過去幾年相關研究表明HIGS可以抑制植物病原菌的生長和致病，如應用于大麥上布氏白粉菌的防治(Nowara,D.等.2010.The plant cel.22(9)：3130-3141)、小麥上條銹菌和鐮刀菌的防治(Panwar,V.等.2013.Plant molecular biology.81(6)：595-608；Koch,A.等.2014.Plant biotechnology journal.12：821-831)、水稻上稻瘟菌的防治(Zhang,D.等.2015.Plant science.237：24-32)以及棉花上大麗輪枝菌的防治(Duan C.G.等.2012.Silence.3(1)：5)。Jahan等人針對致病疫霉4個與致病或細胞結構相關基因分別進行了轉基因沉默植物的構建，發現表達靶向PiGPB1基因的發卡結構的植物抗病性明顯增強，在該轉基因植物葉片內鑒定到24-25nt的小RNA分子可以靶向PiGPB1基因，推測可引起轉錄后水平對靶基因的沉默(Jahan,S.N.等.2015,Journal of experimentalbotany.66(9)：2785-2794)。以上研究說明基于HIGS的跨界基因沉默可有效用于植物病害防治。