[發明專利]基于催化發夾自組裝恒溫擴增技術檢測核酸的通用探針及其應用

有效

• 申請號: 202110594639.7
• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN113201533B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 段文軍;張麗敏;高慶新;陳俊;陳金香;謝寶平;孫斌
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6818;C12Q1/6886
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明屬于分子生物學技術領域，公開了基于催化發夾自組裝恒溫擴增技術檢測核酸的通用探針及其應用。該通用探針，包含發夾探針H1和發夾探針H2；所述發夾探針H1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；所述發夾探針H2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。該通用探針可用于各種目標核酸的檢測，無需根據目標核酸的改變重新設計。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及基于催化發夾自組裝恒溫擴增技術檢測核酸的通用探針及其應用。

背景技術

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤。根據2020年全球癌癥統計，女性乳腺癌已經超過肺癌，成為發病率最高的癌。由于乳腺癌病因尚不明確，早期診治是降低乳腺癌死亡率、提高乳腺癌患者生存質量的關鍵。外泌體是活細胞分泌的可以進入體液循環的細胞外囊泡，具有圓形或杯狀脂質雙分子層結構，粒徑為40～160nm之間，廣泛存在于體液中，包括血液、尿液乳汁等。外泌體通過攜帶親本細胞的一些蛋白質、RNA、DNA等物質可以反映親本細胞的表型狀態，特別是腫瘤細胞。腫瘤細胞分泌的外泌體在外周血中濃度明顯高于非癌性細胞的外泌體，是研究腫瘤診斷生物標志物的寶貴來源。而眾多研究表明，分泌到循環系統中的外泌體包裹的miRNA/piRNA是疾病診斷的一種新型分子標志物。microRNA是一類18～24個核苷酸的非編碼單鏈，在翻譯水平上調控基因的表達。而piRNA是一類24～32個核苷酸，和Argonatue蛋白的PIWI亞家族相互作用，在表觀遺傳基因蛋白調控中起重要作用。眾多研究表明，microRNA/piRNA的表達情況和人類多種惡性腫瘤的發生、發展、診斷預后相關，穩定存在于體液中的microRNA約有90％是包裹于外泌體中，因此說外泌體中的microRNA、piRNA被認為是潛在的疾病生物標志物。

目前檢測RNA的方法主要有Northern?blot、基因微陣列、實時定量熒光PCR(RT-qPCR)、基因表達系列分析、原位雜交、高通量測序、電化學分析等方法，每一種方法都各有長短，但上述方法應用于不易獲得的微量外泌體樣本中痕量RNA測定時，仍需要一系列程序，如外泌體裂解、RNA提取分離、cDNA合成等，對外泌體樣品消耗量較大，且步驟繁瑣耗時，精密度較差，從而影響結果的準確度和可靠性。因此，尋找一種操作簡便、選擇性高、準確廉價、無需分離前處理而能直接檢測循環外泌體中痕量標志物的有效方法非常必要。催化發夾自組裝(Catalytic?Hairpin?Assembly，CHA)作為一種等溫核酸自組裝擴增技術，是一種能夠放大信號的DNA循環回路。在微量目標核酸短鏈存在的情況下，通過toehold介導的鏈置換反應，使兩種互補的亞穩定核酸發夾結構發生循環雜交自組裝反應，產生大量雙鏈DNA產物，以產物中標記的熒光基團信號強度或變化指示目標核酸的含量。由于CHA反應具有設計簡單，背景低，周轉率高的特點，目前已廣泛應用于各種痕量檢測物的擴增分析，主要包括核酸和蛋白質。而傳統的CHA擴增技術也存在著一定的局限性，如擴增所需的H1和H2寡核苷酸發夾結構的序列需根據檢測目標microRNA的序列來設計，每改變一個檢測目標核酸，則需重新設計合成不同的H1和H2序列并優化反應條件，繁瑣耗時，不適用于高通量篩查。同時，尚無將CHA擴增技術用于piRNA檢測的報道。

發明內容

本發明第一方面的目的，在于提供一組基于催化發夾自組裝恒溫擴增技術檢測核酸的通用探針。

本發明第二方面的目的，在于提供一種包含本發明第一方面的通用探針的試劑盒。

本發明第三方面的目的，在于提供本發明第一方面的通用探針和/或第二方面的試劑盒在檢測核酸中的應用。

本發明第四方面的目的，在于提供一種檢測核酸的方法。

為了實現上述目的，本發明所采取的技術方案是：

本發明的第一個方面，提供一組通用探針，包含發夾探針H1和發夾探針H2；所述發夾探針H1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；所述發夾探針H2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。