[發明專利]基于催化發夾自組裝恒溫擴增技術檢測核酸的通用探針及其應用

有效

• 申請號: 202110594639.7
• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN113201533B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 段文軍;張麗敏;高慶新;陳俊;陳金香;謝寶平;孫斌
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6818;C12Q1/6886
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

1.一種檢測核酸的試劑盒，包含：

通用探針；和

啟動發夾H0；

所述核酸為piR-651；

所述啟動發夾H0從5’到3’依次包括：第一序列、第二序列和第三序列；

所述第一序列與所述發夾探針H1的5’端互補，第一序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.17

所示；

所述第二序列與所述核酸互補；

所述第三序列與所述第一序列的3’端及所述第二序列的5’端的三個堿基互補形成莖部分，所述第三序列的堿基數為10個；

所述通用探針包含發夾探針H1和發夾探針H2；所述發夾探針H1的核苷酸序列如SEQ

ID?NO.4所示；所述發夾探針H2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示；所述啟動發夾H

0的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；

所述發夾探針H1上修飾有第一熒光基團，所述發夾探針H2上修飾有第二熒光基團，且所述第一熒光基團與所述第二熒光基團之間可以發生熒光共振能量轉移。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：

所述第一熒光基團和第二熒光基團選自(1)～(3)：

(1)所述第一熒光基團為Cy3，所述第二熒光基團為Cy5；

(2)所述第一熒光基團為Alexa488，所述第二熒光基團為Cy3；

(3)所述第一熒光基團為FITC，所述第二熒光基團為Rhodamine?Red。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：

所述試劑盒還包括NaCl、緩沖液。

4.權利要求1～3中任一項所述的試劑盒在非疾病診斷用途的核酸檢測中的應用。

5.一種非疾病診斷用途的核酸檢測方法，用權利要求3所述的試劑盒檢測待測樣品。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

將待測樣品、啟動發夾H0、發夾探針H1、發夾探針H2、NaCl、緩沖液混合，35～50℃

下孵育2～4h，測定熒光信號強度。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：

所述啟動發夾H0、發夾探針H1、發夾探針H2的摩爾比為30：(50～80)：(50～100)。

8.根據權利要求5～7任一項所述的方法，其特征在于：所述待測樣品包括核酸、預處理后的包含核酸的外泌體和預處理后的包含核酸的血漿。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：所述預處理后的包含核酸的外泌體通過如下方法得到：將包含核酸的外泌體、Triton?X-100、蛋白酶K混合，35～40℃孵育20～40min。

10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：所述預處理后的包含核酸的血漿通過如下方法得到：將包含核酸的血漿與蛋白酶K混合，35～40℃孵育20～40min；加入蛋白酶抑制劑，35～40℃孵育10～30min；加入核糖核酸酶A35～40℃孵育20～40min；加入十二烷基硫酸鈉；加入Triton?X-100、蛋白酶K，35～40℃孵育20～40min。