[發(fā)明專利]一種嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110593384.2
• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN114134125B
• 公開（公告）日: 2023-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔恒林;殷雪矇;侯靖
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/74;C12N1/21;A23L5/20;C02F3/34;C02F101/16;C12R1/01
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本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法及其應(yīng)用；步驟為：首先基于嗜鹽古菌(Haloterrigena?sp.)KZCA68?1的基因組獲得編碼基因nirKsubgt;Htg/subgt;；通過分子克隆技術(shù)將nirKsubgt;Htg/subgt;連接到載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化嗜鹽古菌宿主，得到轉(zhuǎn)化后的重組宿主細(xì)胞在Hv?YPC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期后低溫離心收集菌體，于細(xì)胞裂解液中進(jìn)行重懸，經(jīng)超聲破碎、離心收集上清液，用于重組蛋白純化；采用鎳親和層析純化以及凝膠過濾層析純化后，獲得高純度還原酶，記為NirKsubgt;Htg/subgt;。本發(fā)明得到的NirKsubgt;Htg/subgt;具有良好的酶學(xué)特性，高鹽腌制食品、廢水處理等過程中降解亞硝酸鹽。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種新型嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

亞硝酸鹽作為一種食品添加劑在食品中廣泛應(yīng)用，尤其是各類高鹽食品。過量的亞硝酸鹽攝入會導(dǎo)致慢性致癌和急性中毒，將亞硝酸鹽控制在安全限量內(nèi)是目前國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。利用亞硝酸鹽還原酶降解亞硝酸鹽具有高效、健康等特點(diǎn)，是目前最常用的方法。目前亞硝酸鹽還原酶大多來源于乳酸菌，對鹽的耐受性不強(qiáng)，限制了在高鹽食品工業(yè)中的應(yīng)用。

嗜鹽古菌是一類依賴于高鹽環(huán)境的極端微生物，是耐鹽亞硝酸鹽還原酶的良好微生物來源。目前關(guān)于嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的研究非常有限，主要受限于純酶的制備步驟繁瑣且得率低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，提供一個新型嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的基因及嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法。

本發(fā)明基于一株嗜鹽古菌Haloterrigena?sp.KZCA68-1的基因組獲得一條新型的嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的基因命名為nirK_Htg，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；基于nirK_Htg編碼的新型嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶命名為NirK_Htg。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明包括以下步驟：

(1)構(gòu)建pTA04-nirk_Htg重組表達(dá)質(zhì)粒：

首先基于嗜鹽古菌Haloterrigena?sp.KZCA68-1的基因組獲得一條新型的嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的基因nirK_Htg，進(jìn)一步設(shè)計含有酶切位點(diǎn)EcoRI和BamHI的目的片段引物，利用常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段nirK_Htg；通過分子克隆技術(shù)將nirK_Htg連接到pTA04載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒；

(2)轉(zhuǎn)化嗜鹽古菌Haloferax?volcanii：

將步驟(1)成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化嗜鹽古菌宿主，得到轉(zhuǎn)化后的重組宿主細(xì)胞；所述宿主為菌株Haloferax?volcanii；

將轉(zhuǎn)化后的重組宿主細(xì)胞接種于Hv-YPC液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)后得到培養(yǎng)液；再取培養(yǎng)液接種至Hv-YPC液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至穩(wěn)定期，進(jìn)一步離心收集菌體，低溫保存?zhèn)溆茫?/p>

(3)重組亞硝酸鹽還原酶的純化：

收集步驟(2)保存的菌體于細(xì)胞裂解液中進(jìn)行重懸，重懸后超聲破碎細(xì)胞，離心后收集上清液，即粗酶液，將粗酶液用于重組蛋白純化；首先采用鎳柱親和層析純化獲得含有咪唑的目的蛋白；最后利用凝膠過濾層析去除咪唑，獲得高純度的嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶，記為NirK_Htg。

優(yōu)選的，步驟(1)中所述嗜鹽古菌(Haloterrigena?sp.)KZCA68-1保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心菌種保藏號為CGMCC?22195，保藏日期：2021年4月16日。