[發(fā)明專利]一種嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110593384.2
• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN114134125B
• 公開（公告）日: 2023-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔恒林;殷雪矇;侯靖
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/74;C12N1/21;A23L5/20;C02F3/34;C02F101/16;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)構(gòu)建pTA04-nirk_Htg重組表達(dá)質(zhì)粒：

首先基于嗜鹽古菌(Haloterrigena?sp.)KZCA68-1的基因組獲得一條嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的基因nirK_Htg，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；進(jìn)一步設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)EcoRI和BamHI的目的片段引物，利用常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段nirK_Htg；通過分子克隆技術(shù)將nirK_Htg連接到pTA04載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒；

所述嗜鹽古菌(Haloterrigena?sp.)KZCA68-1保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號為CGMCC?22195；

(2)轉(zhuǎn)化嗜鹽古菌(Haloferax?volcanii)：

將步驟(1)成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化嗜鹽古菌宿主，得到轉(zhuǎn)化后的重組宿主細(xì)胞；所述宿主為菌株Haloferax?volcanii；

將轉(zhuǎn)化后的重組宿主細(xì)胞接種于Hv-YPC液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)后得到培養(yǎng)液；再取培養(yǎng)液接種至Hv-YPC液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至穩(wěn)定期，進(jìn)一步離心收集菌體，低溫保存?zhèn)溆茫?/p>

(3)重組亞硝酸鹽還原酶的純化

收集步驟(2)保存的菌體于細(xì)胞裂解液中進(jìn)行重懸，重懸后超聲破碎細(xì)胞，離心后收集上清液，即粗酶液，將粗酶液用于重組蛋白純化；首先采用鎳柱親和層析純化獲得含有咪唑的目的蛋白；最后利用凝膠過濾層析去除咪唑，獲得高純度的嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶，記為NirK_Htg。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述嗜鹽古菌(Haloferax?volcanii)購自日本微生物菌種保藏中心，菌種保藏號為：JCM?8879。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述Hv-YPC培養(yǎng)基成分為：酵母提取物5.0g，大豆蛋白胨1.0g，酸水解酪素1.0g，KCl4.2g，MgSO₄·7H₂O?33.0g，MgCl₂·6H₂O?30.0g，NaCl?144.0g，1M?Tris-HCl(pH?8.0)12.0mL，CaCl₂?0.33g，上述組分用蒸餾水定容于至1L，調(diào)節(jié)pH至7.5，115℃滅菌30min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述活化培養(yǎng)的條件為：37℃，180rpm培養(yǎng)3～4天；所述的低溫保存的溫度為-20℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的鎳柱親和層析純化的具體操作為：首先20倍柱床體積的Lysis?buffer用于平衡鎳柱；將離心后的上清液上樣；然后使用緩沖液I洗脫雜蛋白；緩沖液II洗脫目的蛋白，最后獲得含有咪唑的目的蛋白。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法，其特征在于，所述緩沖液I成分為2M?NaCl，20mM?Tris-HCl，40mM咪唑，pH?8.0；所述緩沖液II成分為2M?NaCl，20mM?Tris-HCl，250mM咪唑，pH?8.0；所述Lysis?buffer成分為2M?NaCl，20mM?Tris-HCl，pH8.0。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中所述凝膠過濾層析為利用pure蛋白分離純化系統(tǒng)，HiTrap^TM?Desalting層析柱去除咪唑，以Lysis?buffer為流動(dòng)相，通過凝膠過濾層析獲得高純度的嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶，即為NirK_Htg。