[發(fā)明專利]一種重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白及其制備方法與應(yīng)用

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• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN113416725A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范小蔓;黃佳瀅;張業(yè)旺
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/26;C12R1/19
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本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組硫酸軟骨素酶ABC?I蛋白及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明使用分子克隆技術(shù)通過提取硫酸軟骨素酶ABC?I基因設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后與表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體；將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，構(gòu)建重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，實(shí)現(xiàn)重組硫酸軟骨素酶ABC?I蛋白的可溶性表達(dá)。構(gòu)建過程操作簡單，成本低。所構(gòu)建的重組硫酸軟骨素酶ABC?I蛋白表達(dá)量高、具有較高的酶活性，粗酶活性可達(dá)到7144U/L，經(jīng)Ni?NTA純化后，酶活力為492.1 U/mg；且穩(wěn)定性好，37℃下的半衰期為120 min，在4℃下的半衰期為112天。在生產(chǎn)低分子量硫酸軟骨素中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，在醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域上前景廣闊。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate）是一類糖胺聚糖(GAGs)的陰離子生物大分子，通常以共價(jià)連接到蛋白質(zhì)。在包括神經(jīng)元發(fā)育、凝血、炎癥、細(xì)胞運(yùn)輸、細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生等過程中起著重要作用。硫酸軟骨素作為結(jié)締組織中天然存在的成分，能夠與水分子結(jié)合從而起到潤滑和支撐關(guān)節(jié)的作用，使關(guān)節(jié)能夠活動自如，減輕關(guān)節(jié)疼痛。此外，它還被證明可作為具有乳化特性的食品防腐劑使用，并可用于營養(yǎng)配方，以預(yù)防和減少骨關(guān)節(jié)炎。硫酸軟骨素需要在細(xì)胞內(nèi)起作用，但它的大分子體積會影響其順利穿過細(xì)胞表面的一層薄膜，而無法在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮出其多種良好的藥理功能。低分子量的硫酸軟骨素因具有溶解性好及生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)具有更好的生物化學(xué)特性。

硫酸軟骨素ABC裂解酶(Chon-ABC，EC 4.2.2.4)是一類具有廣泛特異性的糖胺酶，通過β-消除反應(yīng)降解硫酸軟骨素糖胺聚糖(GAGs)。根據(jù)裂解機(jī)理，Chon-ABCs分為內(nèi)源性消除酶(Chon-ABC-I，能將硫酸軟骨素解聚為不飽和的四糖和二糖)和外源性消除酶(Chon-ABC-II，能將硫酸軟骨素六四糖降解為二糖)。Chon-ABC-I因在硫酸軟骨素低聚糖降解方面的應(yīng)用具有很好的醫(yī)用前景。主要通過發(fā)酵和純化工藝制備硫酸軟骨素酶ABC-I，但存在酶活性低、生產(chǎn)繁瑣、成本高等問題。為了增加可溶性表達(dá)和活性，引入分子伴侶蛋白用于異源表達(dá)。但其生產(chǎn)仍然繁瑣，且存在表達(dá)過程中包涵體形成、蛋白回收率低等問題。目前尚缺乏一種低成本、高穩(wěn)定性的硫酸軟骨素酶ABC-I制備工藝。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明通過分子克隆的方法提供一種重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明的重組硫酸軟骨素酶ABC-I具有較高的酶活力及穩(wěn)定性能，制備方法簡單、成本低，可用于工業(yè)化生產(chǎn)低分子量的硫酸軟骨素酶ABC-I。

本發(fā)明的方案通過如下技術(shù)手段得以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，編碼1006個(gè)氨基酸，分子量108 kDa。

另一方面，本發(fā)明還提供了編碼上述硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白的一種氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本發(fā)明還提供了一種重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白的構(gòu)建方法，具體包括如下步驟：

（1）以多形擬桿菌硫酸軟骨素酶ABC-I基因組為模板，采用分別帶有NdeI和XbaI酶切位點(diǎn)及5’端保護(hù)堿基為引物，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增編碼獲得目的基因片段；

（2）將目的基因片段與表達(dá)載體pCznl連接構(gòu)建硫酸軟骨素酶ABC-I基因的pCznl-Chon-ABC-I重組表達(dá)載體；

（3）將步驟（2）中構(gòu)建的pCznl-Chon-ABC-I重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌宿主菌中，構(gòu)建硫酸軟骨素酶ABC-I基因大腸桿菌工程菌；

（4）硫酸軟骨素酶ABC-I基因大腸桿菌工程菌中重組硫酸軟骨素酶的誘導(dǎo)表達(dá)；

（5）分離純化步驟（4）所得的表達(dá)產(chǎn)物，獲得重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白。