[發(fā)明專(zhuān)利]一種重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白及其制備方法與應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110591614.1
• 申請(qǐng)日: 2021-05-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113416725A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范小蔓;黃佳瀅;張業(yè)旺
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/88
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/26;C12R1/19
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1.一種重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白，其特征在于，所述重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，編碼1006個(gè)氨基酸，分子量108 kDa。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一種重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）以多形擬桿菌硫酸軟骨素酶ABC-I基因組為模板，采用分別帶有NdeI和XbaI酶切位點(diǎn)及5’端保護(hù)堿基為引物，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增編碼獲得目的基因片段；

（2）將目的基因片段與表達(dá)載體pCznl連接構(gòu)建硫酸軟骨素酶ABC-I基因的pCznl-Chon-ABC-I重組表達(dá)載體；

（3）將步驟（2）中構(gòu)建的pCznl-Chon-ABC-I重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌宿主菌中，構(gòu)建硫酸軟骨素酶ABC-I基因大腸桿菌工程菌；

（4）硫酸軟骨素酶ABC-I基因大腸桿菌工程菌中重組硫酸軟骨素酶的誘導(dǎo)表達(dá)；

（5）分離純化步驟（4）所得的表達(dá)產(chǎn)物，獲得重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1）中所述引物的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；下游引物序列如SEQ ID NO：2所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1）中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)參數(shù)為：95℃起始變性4 min，95℃變性30 s，60℃退火55 s，72℃延伸1 min，循環(huán)20次，72 ℃延伸10 min。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2）中所述的目的基因片段與表達(dá)載體pCznl均分別使用NdeI和 XbaI進(jìn)行雙酶切處理。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2）中所述連接的條件為25℃，12小時(shí)；連接體系為：載體2 μL，目的基因6 μL，10×Ligation buffer 1 μL，T4DNA連接酶1 μL。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（4）中所述的誘導(dǎo)表達(dá)為：硫酸軟骨素酶ABC-I基因大腸桿菌工程菌接種到5 mL含有終濃度50 ug/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜制得種子液，將種子液接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6~0.8后，添加終濃度為0.75 mM的IPTG在25℃下振蕩6 h。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（5）中所述的重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白的分子量為108 kDa。

10.一種如權(quán)利要求1所述的重組硫酸軟骨素酶ABC-I蛋白在制備低分子量硫酸軟骨素中的應(yīng)用。