[發明專利]一種提高大豆胞囊線蟲侵染效率的抗性鑒定方法

有效

• 申請號: 202110588951.5
• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN113179898B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 練云;盧為國;李海朝;王仕偉;雷晨芳;李金英;武永康;王金社
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: A01G22/40
• 分類號: A01G22/40;A01G7/06;A01G7/00
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

1.一種提高大豆胞囊線蟲侵染效率的抗性鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）選擇受大豆胞囊線蟲感染的病土和無菌細沙分別以3∶0.5~1.0的體積比均勻混合，制備成試驗病土；將萌發3~5 d，子葉出土期的感病對照大豆Lee植株移栽至裝有試驗病土的實驗杯中，每個實驗杯移栽1株，并放入底部墊有4cm高底濾網的塑料筐中培養；

培養條件為：白天16h與黑夜8h輪替；溫度：白天27℃±1℃，黑夜24℃±1℃；濕度65-70%；其中白天在塑料筐注入0.3cm-0.5cm高的水，黑夜時保持塑料筐底部干燥；

（2）待大豆Lee植株培養25 d后，將大豆Lee植株從試驗病土中倒出，采用淘洗-過篩法從根系中分離大豆胞囊，依次用“25目-60目-100目”篩網，將從根系上沖洗的大豆胞囊搜集至100目篩網上；經過破碎胞囊、蔗糖梯度離心法進行純化處理后，在顯微鏡下對大豆胞囊線蟲蟲卵進行計數，用于后續接種；

（3）將萌發3~5 d的待鑒定材料移栽至無菌土中，每個材料重復4次，3-5d后長出新根，用3×75mm螺絲刀，在緊挨著待鑒定材料根系旁邊扎孔，隨后借助1mL槍頭輔助將步驟（2）所得接種液通過孔洞注入根系附近，接種時分兩次進行，每次注入一個孔，一次接種1500個蟲卵/株，兩次接種間隔24h；

（4）將蟲卵接種至待鑒定材料后，在溫室培養25天，將待鑒定材料植株從試驗病土中倒出，采用淘洗-過篩法從根系中分離胞囊，計數根系上大豆胞囊數目；

（5）根據待鑒定材料平均每株根系上的大豆胞囊數目計算胞囊指數FI，確定抗病等級。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述受大豆胞囊線蟲感染的病土中，選擇大豆胞囊線蟲為1號、2號、3號、4號或5號生理小種中的一種或多種。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述實驗杯的規格為：上口直徑×下口直徑×高=70mm×50mm×90mm；塑料筐的內部尺寸為：長×寬×高=530mm×341mm×70mm。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述純化處理的具體步驟為：用橡皮塞破碎大豆胞囊、釋放蟲卵，蟲卵依次通過“100目-200目-500目”的篩網進行篩分，最后將蟲卵搜集至500目篩網上，利用洗瓶和漏斗，將蟲卵轉移至50mL離心管，體積控制在20mL以內，加入20mL質量分數為40%的蔗糖溶液，輕輕顛倒混勻；在2000rpm條件下離心5min；

若出現分層，則取用中間的一層蟲卵，棄掉上部上清和底部沉淀，在600目篩網上過濾，清水洗滌去除蔗糖，在洗瓶和漏斗的輔助下將蟲卵沖洗至燒杯，稀釋后，取10μL在顯微鏡下計數大豆胞囊線蟲蟲卵數目，用于后續接種；

若未分層，則吸取上清液中的蟲卵，棄掉底部沉淀，并將吸取的上清液在600目篩網上過濾，清水洗滌去除蔗糖，留蟲卵在600目篩網上；在洗瓶和漏斗的輔助下將蟲卵沖洗至燒杯，稀釋后，取10μL在顯微鏡下計數大豆胞囊線蟲蟲卵數目，用于后續接種。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，若用于鑒定試驗的感病對照Lee單株根系上大豆胞囊數目大于或等于100，則認定此次試驗數據有效；若用于鑒定試驗的感病對照Lee單株根系上大豆胞囊數目小于100，將重復步驟（1）、（2），利用感病對照Lee再次擴繁該病土中的胞囊數量，直到繁殖出足夠用于接種鑒定的蟲卵量，再開展抗性鑒定。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述胞囊指數FI =待鑒定植株根系上的平均胞囊數目/感病對照Lee植株上的胞囊數目×100。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述胞囊指數FI與抗病等級的關系為：FI=0，免疫；0FI≤10，抗病；10FI≤30，中抗；30FI≤60，中感；FI60，感病。