[發(fā)明專利]針對C型逆轉(zhuǎn)錄病毒的數(shù)字PCR檢測用引物及檢測方法

在審

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• 申請日: 2021-05-28
• 公開（公告）號: CN113186353A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 令吉明;楊洋;朱玉懿;張婧;劉昆
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州晶佰生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州睿途知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 41183
• 代理人: 李伊寧

本申請屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對C型逆轉(zhuǎn)錄病毒（C?type retrovirus）的數(shù)字PCR（dPCR）檢測技術(shù)專利申請事宜。針對C型逆轉(zhuǎn)錄病毒設(shè)計引物組，適用于數(shù)字PCR檢測應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)中，針對CHO細胞中C型逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測時，QPCR技術(shù)是最為常用技術(shù)。但鑒于QPCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確性問題，為了進一步提高檢測的準(zhǔn)確度，結(jié)合新興的絕對定量的數(shù)字PCR技術(shù)，本申請中，發(fā)明人通過對特異性引物序列篩選和反應(yīng)體系優(yōu)化，明顯提高了C型逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測的準(zhǔn)確性，提高了以CHO細胞為宿主表達系統(tǒng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，同時也為其他病毒檢測、細胞基因治療技術(shù)的應(yīng)用提供了良好的借鑒和參考。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對C型逆轉(zhuǎn)錄病毒（C-typeretrovirus）的數(shù)字PCR（dPCR）檢測技術(shù)專利申請事宜。

背景技術(shù)

中國倉鼠卵巢(CHO)細胞是一種藥用重組蛋白和疫苗生產(chǎn)中的常用細胞，其具有如下優(yōu)良特點：(1)適用于懸浮培養(yǎng)，可以滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的要求；(2)產(chǎn)生的抗體分子在結(jié)構(gòu)、功能方面和天然抗體分子較接近；(3)所含人類病毒極少；(4)外源基因可以在CHO細胞中穩(wěn)定地整合；(5)CHO細胞是成纖維細胞，幾乎不分泌內(nèi)源性蛋白，因此對目標(biāo)重組抗體的分離純化工作十分有利。

盡管CHO細胞中沒有人類病毒，并且應(yīng)用較為廣泛。但已有研究也已證實，CHO 細胞可以表達內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病樣顆粒，在細胞上清中通?？梢詸z測到 10^3~10⁹ /ml的逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒，尤其是通過電子顯微鏡可以清楚觀察到CHO細胞中含有C型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。也因此，為了保證在CHO細胞中表達生產(chǎn)的抗體藥和疫苗等重組蛋白藥物的安全性，需要在生產(chǎn)環(huán)節(jié)和純化后對相關(guān)病毒顆粒量進行準(zhǔn)確檢測和定量，尤其是CHO細胞系中C型逆轉(zhuǎn)錄病毒的定量檢測。

現(xiàn)有技術(shù)中，最常用的分子檢測方法是熒光定量PCR（QPCR）法，其可以通過利用Taqman探針法特異性檢測C型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的含量。由于每個逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒包含兩個病毒基因組RNA分子，因此，通過檢測病毒基因組RNA拷貝數(shù)，便可以推算出每制劑的病毒含量。但由于熒光定量PCR屬于相對定量，因此，在具體絕對定量病毒拷貝數(shù)時需要先用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此導(dǎo)致病毒拷貝數(shù)檢測結(jié)果主要取決于標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)曲線）的準(zhǔn)確性。但實際檢測定量中，影響定量PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性因素還有：擴增效率、PCR干擾因素、標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確性等諸多因素。此外，C型逆轉(zhuǎn)錄病毒的定量檢測時，一般是取CHO細胞培養(yǎng)上清來純化病毒核酸，而上清中大量的細胞碎片、蛋白、雜質(zhì)核酸等雜物，也會干擾PCR擴增，進而導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。正是基于這些問題，急需一種較好的、較為簡便的病毒拷貝數(shù)準(zhǔn)確定量方法，從而為相關(guān)病毒含量的準(zhǔn)確確定奠定基礎(chǔ)。

數(shù)字PCR技術(shù)作為第三代PCR技術(shù)，是一種單分子擴增技術(shù)，是一種不依賴標(biāo)準(zhǔn)品的絕對定量技術(shù)。與傳統(tǒng)的熒光定量相比，可實現(xiàn)單分子檢測，具有檢測準(zhǔn)確性高、靈敏性高和抗PCR擴增抑制能力的優(yōu)點。與QPCR相同，數(shù)字PCR技術(shù)可以利用TaqMan探針或SYBRGreen染料進行熒光信號檢測，最后利用終點信號檢測法和泊松分布統(tǒng)計計算，實現(xiàn)樣品的絕對定量。

鑒于QPCR在CHO細胞的C型逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測中仍然存在明顯改進空間，因此，如何利用數(shù)字PCR技術(shù)來實現(xiàn)和改進CHO細胞中C型逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測工作，對于確保相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性具有十分重要的技術(shù)意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有CHO細胞中的C型逆轉(zhuǎn)錄病毒，本申請目的提供一組針對C型逆轉(zhuǎn)錄病毒的數(shù)字PCR檢測用引物，從而為相關(guān)病毒顆粒的準(zhǔn)確檢測和定量奠定一定技術(shù)基礎(chǔ)。

本申請所采取的技術(shù)方案詳述如下。

針對C型逆轉(zhuǎn)錄病毒的數(shù)字PCR檢測用引物組，該引物組針對C型逆轉(zhuǎn)錄病毒（C-type retrovirus，GenBank accession number：U09104）設(shè)計，適用于數(shù)字PCR（dPCR）檢測應(yīng)用，具體引物設(shè)計為：