[發明專利]一種用于檢測桃拉綜合征病毒的CRISPR-Cas13a等溫檢測引物組及應用

在審

• 申請號: 202110585330.1
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113186352A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 黃俊;張徐俞;李業;楊穩;付媛媛;朱凝瑜;鄭曉葉;俞曉平;駱志成;樊偉東
• 申請（專利權）人: 杭州奧盛儀器有限公司;浙江科技學院;浙江省水產技術推廣總站
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種用于檢測桃拉綜合征病毒的CRISPR?Cas13a等溫檢測引物組及應用。所述CRISPR?Cas13a等溫檢測引物組包括一個包含三條crRNA的crRNA組和一個RNA探針，三條crRNA分別命名為：TSV?crRNA3、TSV?crRNA5和TSV?crRNA7，RNA探針命名為TSV?Probe。本發明檢測操作簡便快速，適合現場檢測；特異性強；檢測靈敏度高，可達到10²copy/反應；準確率高、可靠，具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物技術檢測技術領域，特別是涉及一種用于檢測桃拉綜合征病毒的CRISPR-Cas13a等溫檢測引物組及應用。

背景技術

對蝦桃拉綜合征俗稱＂紅尾?。?，是由桃拉綜合征病毒(Taura syndrome virus，TSV)引起的一種嚴重傳染性對蝦疾病。癥狀急性期以蝦體變紅、軟殼，過渡期以角質上皮不規則黑化為特征。

桃拉綜合征病毒(Taura syndrome virus，TSV)是一種無囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒顆粒徑長31～32nm，屬于小RNA病毒家族，其主要宿主為南美對蝦，該病毒能夠感染甲殼上皮(如附肢、鰓、胃、食道、后腸)、結締組織等，造成病蝦不攝食，消化道內無食物；游泳無力、反應遲鈍；甲殼變軟，蝦體變紅，尤其是尾扇變紅，所以本病又稱為紅尾病，一般幼蝦的死亡率高達80％。造成對蝦養殖業重大的經濟損失，目前已被世界動物衛生組織(OIE)列為必須要進行申報的病毒之一。因此，建立靈敏、準確、快捷、方便的檢測方法是減少該病發生和危害的重要途徑。

目前，檢測對蝦是否感染桃拉綜合征病毒通常采用病理學顯微鏡觀察、生化測定、免疫學試驗、細胞培養、PCR和液相芯片技術等，但這些方法操作繁瑣、耗時長、檢測儀器昂貴，在養殖場實踐應用中存在很多困難，很難適應當前快速、準確檢測的需要，不適合基層快速篩查。

比如，公開號為CN101915834A的發明涉及一種對蝦桃拉綜合征病毒(TSV)膠體金檢測試紙條，試紙條底板一端為膠體金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗體結合物玻璃纖維膜，抗體固相硝酸纖維素膜位于中間，其上劃有一條鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗體檢測線(T線)和一條羊抗兔IgG質控線(C線)，底板另一端為吸水紙。當被檢樣品中帶TSV時，TSV首先與膠體金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗體形成復合物，在毛細作用下前移至鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗體時被捕捉，即發生雙抗夾心特異結合，在檢測線處膠體金顆粒富集呈紅色，因而可檢測樣品中是否含有TSV。

近年來，基因編輯技術的出現為其帶來了一種更簡便靈敏的檢測方式，參照Jennifer A.Doudna的文章“Amplification-free detection of SARS-CoV-2 withCRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy”(Cell,Volume 184,Issue 2,21 January2021,Pages 323-333.e9)，該方法利用Cas13a酶在37℃恒溫條件下，在無擴增的條件下，利用crRNA的引導與目標序列結合后，激活Cas13a蛋白的附屬切割活性，高效切割體系內其它的單鏈RNA。在體系內加入含有報告基團的單鏈RNA探針底物后，如果Cas13a識別到靶序列的存在，就會切割單鏈RNA探針底物從而釋放熒光報告基團。該技術具有以下特點：(1)無需擴增，等溫檢測：試劑盒無擴增需求，且在37℃恒溫條件下檢測；(2)特異性：本試劑盒含有探針引物，能特異性的結合目標，能有效的避免假陽性現象；(5)靈敏度：本試劑盒能檢測到10²copy/μL。

發明內容

本發明針對現有技術中存在的上述不足，提供了一種用于檢測桃拉綜合征病毒的CRISPR-Cas13a等溫檢測引物組，及利用該CRISPR-Cas13a等溫檢測引物組來檢測桃拉綜合征病毒的方法。