[發(fā)明專利]一種用于檢測桃拉綜合征病毒的CRISPR-Cas13a等溫檢測引物組及應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110585330.1
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113186352A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發(fā)明（設計）人: 黃俊;張徐俞;李業(yè);楊穩(wěn);付媛媛;朱凝瑜;鄭曉葉;俞曉平;駱志成;樊偉東
• 申請（專利權）人: 杭州奧盛儀器有限公司;浙江科技學院;浙江省水產技術推廣總站
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

1.一種用于檢測桃拉綜合征病毒的CRISPR-Cas13a等溫檢測引物組，其特征在于，包括一個包含三條crRNA的crRNA組和一個RNA探針，三條crRNA分別命名為：TSV-crRNA3、TSV-crRNA5和TSV-crRNA7，RNA探針命名為TSV-Probe，核苷酸序列分別為：

TSV-crRNA3：GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACAGCAAATCACACTGTTCACACTTGAAGA；

TSV-crRNA5：GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGTGGGGAGCTTAAACTGGACACACTGTG；

TSV-crRNA7：GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACTATTTTCTCGCTCAATTTCCTCACACAA；

TSV-Probe：Fam-_rU_rU_rU_rU_rU-BHQ1。

2.如權利要求1所述的CRISPR-Cas13a等溫檢測引物組在制備用于檢測桃拉綜合征病毒的試劑盒中的應用。

3.一種用于檢測桃拉綜合征病毒的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的CRISPR-Cas13a等溫檢測引物組。

4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括陽性對照，所述陽性對照為含有桃拉綜合征病毒的RNA片段，序列如SEQ ID No.1所示。

5.一種非疾病診斷為目的的檢測桃拉綜合征病毒的方法，其特征在于，使用權利要求3或4所述試劑盒，所述方法包括以下步驟：

(1)待檢樣品RNA的提取；

(2)CRISPR等溫檢測反應，以步驟(1)提取的待檢樣品RNA作為模板，使用權利要求1所述的CRISPR-Cas13a等溫檢測引物組進行等溫擴增反應，等溫擴增反應使用等溫擴增儀；

(3)結果判斷：通過等溫擴增儀自行分析反應中的熒光變化來判斷反應擴增結果，儀器軟件界面出現(xiàn)擴增曲線為陽性，表明待檢樣品含有桃拉綜合征病毒；否則為陰性，表明待檢樣品不含桃拉綜合征病毒。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)中采用動物組織RNA提取試劑盒提取樣品總RNA。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中CRISPR等溫檢測反應時反應體系：10×Cas13a緩沖液2μL，Cas13a酶1μL，crRNA 1μL；RNase抑制劑1μL；TSV-Probe 0.5μL，模板1μL，用超純水補齊至20μL。

8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中等溫擴增程序為：37℃反應60min。