[發明專利]pAM基因及其植物表達載體和應用

有效

• 申請號: 202110584439.3
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113249399B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 潘煒松;陳剛;謝東玲;吳川
• 申請（專利權）人: 長沙諾合松生物科技合伙企業（有限合伙）
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/82;C12N15/66;A01H5/12;A01H6/82
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所(普通合伙) 43008
• 代理人: 鄒大堅;黃麗

本發明公開了一種pAM基因及其植物表達載體和應用，pAM基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，植物表達載體由pAM基因與植物載體重組構建而成，可應用于制備轉基因植物。本發明的pAM基因及其植物表達載體可增加載體在表達目的基因的表達量，對于一些在載體中使植物致死的病毒也可以進行替換。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種pAM基因及其植物表達載體和應用。

背景技術

利用病毒載體的瞬時表達系統具有在幾天內快速高水平表達外源蛋白的優勢。在已知的幾種植物病毒衍生表達載體系統，迄今為止描述的最有效的表達載體是基于DNA病毒，特別是雙型病毒或單鏈正感RNA病毒，如煙草病毒，馬鈴薯x病毒組和豇豆花葉病毒組。但是，目前這些技術尚存在以下缺陷：(1)大部分植物載體在表達目的基因(蛋白或者多肽)時，表達量都特別低，達不到生產的要求；(2)部分利用植物病毒構建的植物載體所用的病毒對植物傷害比較大，容易使植物致死。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種可增加載體表達目的基因的表達量、對植物友好的pAM基因及其植物表達載體和應用。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案。

一種pAM基因，所述pAM基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

上述的pAM基因，優選的，所述pAM基因由開放閱讀框與鷹嘴豆褪綠性矮縮病毒基因組中的LIR、C1:C2、SIR基因組成，排列方式為LIR→C1:C2→SIR→開放閱讀框→LIR，所述開放閱讀框包含啟動子NOS terminator、克隆位點和終止子CaMV 35S promoter，所述鷹嘴豆褪綠性矮縮病毒具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

作為一個總的技術構思，本發明還提供一種植物表達載體，所述植物表達載體由上述的pAM基因與植物載體重組構建而成。即任意一種植物表達載體均可使用pAM基因進行改造得到新的載體。

上述的植物表達載體，優選的，所述植物載體為pEGAD，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所得植物表達載體為pEGM，具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

上述的植物表達載體，優選的，所述植物表達載體由以下方式構建得到：

(1)將植物載體pEGAD用PacI、KpnI進行雙酶切，回收大片段，得到pEGAD-PacI/KpnI；

(2)在pAM的上游加入PacI的酶切位點ttaattaa，在pAM的下游加入KpnI的酶切位點ggtacc，合成質粒pUC57-pAM，用PacI、KpnI、BspQI三個酶進行酶切反應，回收片段，得到pAM-PacI/KpnI；

(3)用DNA連接酶將片段pEGAD-PacI/KpnI與片段pAM-PacI/KpnI連接起來，構建得到植物表達載體pEGM。

上述的植物表達載體，優選的，所述pAM基因設在所述植物載體的RB與LB之間，排列方向為RB→LIR→C1:C2→SIR→終止子→克隆位點→啟動子→LIR→LB。

作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述的植物表達載體在制備轉基因植物中的應用。

上述的應用，優選的，所述植物為煙草葉。

本發明中，采用的鷹嘴豆褪綠性矮縮病毒(Chickpea chlorotic dwarf virus；AM933135)是一種雙鏈病毒，它具有單鏈環狀DNA基因組，可以通過植物細胞核內的滾環復制機制，以類似質粒的dsDNA形式復制到非常高的拷貝數。

與現有技術相比，本發明的優點在于：