[發明專利]一種適用于陸地棉的基因精準高效編輯的方法

在審

• 申請號: 202110583896.0
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113337539A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 金雙俠;張獻龍;余露;王瓊瓊
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/60
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 張國棟

本發明涉及植物基因工程技術領域，且公開了一種適用于陸地棉的基因精準高效編輯的方法，所述該載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。該適用于陸地棉的基因精準高效編輯的方法，通過對含有棉花內源啟動子pGhU6?7的pRGEB32?GhU6.7?NPTⅡ載體進行改造，以BeYDV雙生病毒中復制子元件為載體，將sgRNA序列構建在復制環內，構建了在棉花中具有基因編輯功能的載體BeYDV?Cas9，選取GhCLA為目標基因驗證BeYDV?Cas9在棉花中的應用，并且設計1個靶標，利用農桿菌介導的遺傳轉化將BeYDV?Cas9基因編輯系統導入棉花基因組，對轉基因植株進行Sanger測序，檢測本發明在異源四倍體棉花基因組中的編輯效率類型，從而有效的解決了傳統的CRISPR?Cas9系統在對陸地棉進行基因編輯時無能為力，且并無可行有效編輯工具的問題。

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域，具體為一種適用于陸地棉的基因精 準高效編輯的方法。

背景技術

CRISPR/Cas系統(Clustered regularlyinterspaced short palindromicrepeats/CRISPRassociated protein)是細菌和古菌在抵御外來病毒和噬菌體 入侵的過程中不斷迚化而來的一種獲得性免疫防御機制，CRISPR/Cas9系統是 目前應用最多最廣泛的基因編輯系統，能夠高效特異和靈活的識別靶基因中 的特定位點，然而，隨著研究的不斷深入，CRISPR/Cas9也暴露了比較嚴重的 脫靶效應(Hsu et al 2014)、PAM序列的限制導致其切割位點較少及基因編 輯后后代不易純合等缺陷，因此需要改造CRISPR/Cas9系統，降低其脫靶效 應，提高基因編輯精準度，擴大靶標位點范圍，尋找新的基因編輯系統。

Geminivirus是一類擁有眾多成員的植物病毒，它們的基因組由2.5-3kb 的單鏈環狀DNA組成，能浸染大多數單子葉和雙子葉植物，并且能被改造成 HDR所需的供體分子，當Geminivirus浸染植物細胞后，它們具有快速浸染、 增殖、轉錄、表達而不整合入植物基因組的特點，從使得細胞內以滾環復制 的方式產生大量的供體分子，數量可高達數百至數千拷貝，一次，將生病毒 在植物體內滾環復制提供大量sgRNA模板，可大量增加植物體內的Cas9蛋白 和sgRNA含量可以有效的促進在植物基因組中精確高編輯。

目前，BeYDV介導的基因編輯系統系統在很多物種中被報道，但是在異源 四倍體棉花中尚無報道，陸地棉是一種廣泛種植的異源四倍體(AtDt)，其基 因組中的許多基因具有高度同源性，并且基因組比較復雜及龐大，傳統的 CRISPR-Cas9系統在需要對某些特定基因進行編輯及功能分析時無能為力，其 并無可行而又有效的精準編輯工具，為棉花基因組功能分析，作物遺傳改良 和新品種選育提供重要技術支持，因此難以滿足社會需求，故而提出一種適 用于陸地棉的基因精準高效編輯的方法來解決上述中所提出的問題。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種適用于陸地棉的基因精準高效 編輯的方法，具備可精準編輯基因等優點，解決了傳統的CRISPR-Cas9系統 在對陸地棉進行基因編輯時無能為力，且并無可行有效編輯工具的問題。

(二)技術方案

為實現上述可精準編輯基因的目的，本發明提供如下技術方案：一種適 用于陸地棉的基因精準高效編輯的方法，所述該載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一種適用于陸地棉的基因精準高效編輯的方法，所述該載體的核苷酸序 列如SEQID NO:2所示，該載體通過下列步驟制備獲得：

1)、獲得目的序列復制子元件(BeSRL)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO： 3所示，具體地，該目的序列通過以下步驟制備獲得：