[發明專利]一種微生物源雙鏈RNA的快速制備方法

在審

• 申請號: 202110583398.6
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113151335A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 莫芹;唐雪明;呂貝貝;孫宇;吳瀟;宋麗莉
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/113;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

一種微生物源雙鏈RNA的快速制備方法，通過將靶標基因插入含有T7啟動子的表達型載體，將含靶標基因的表達載體轉化至RNase III缺陷型大腸桿菌HT115(DE3)，獲得表達菌株；將表達菌株加入含有氨芐青霉素和四環素的TB液體培養基中，搖床過夜培養，再轉接菌液至TB培養基，搖床培養后加入IPTG誘導劑，誘導17?22h后結束發酵；將重組菌細胞懸浮于高鹽濃度的TE緩沖液中，破碎細胞經過60?80℃加熱40?60min后，離心獲得dsRNA生物制劑。本發明提高了dsRNA的合成效率，降低生產成本，dsRNA的最終產量能達到17.90±4.20μg/mL。

技術領域

本發明屬于農業病蟲害防治領域，具體涉及一種微生物源雙鏈RNA的快速制備方法。

背景技術

隨著全球化的進行和環境變化，加劇了病蟲害的分布和擴散，嚴重威脅人類的糧食安全問題，也迫使人們去開發新型可持續的病蟲害防治策略。

RNA干擾技術(RNA interference，RNAi)是一項頗具潛力的綠色防控策略，可以選擇任一基因作為靶標，能專一性地抑制靶標基因的實質表達，在線蟲、節肢動物、植物病毒、真菌和其他病原菌等病蟲害的防治方面均有大量研究報道。

RNAi途徑是所有真核生物中控制基因表達水平的一種轉錄后調控方式，外源和內源的雙鏈RNA(dsRNA)都可以誘導RNAi，從而特異性降解靶標mRNA分子。利用這一機制，可以開發出一整套可利用的害物防治方法，其中包括傳統的轉化形式即轉基因植物，以及將dsRNA加工成不同制劑的形式。相比于轉基因形式，后者相對開發成本低，不受轉基因監管的限制，具有很好的產品開發應用前景。

目前RNAi在農作物保護方面的研究還面臨諸多挑戰，其中至關重要的一個便是如何廉價地制備大量的dsRNA以解決農業應用中的成本問題。目前，dsRNA的大量合成方法主要有體外酶法和微生物發酵法。

體外酶法主要利用T7噬菌體的DNA依賴型RNA聚合酶(DdRP)對特定的DNA模板進行轉錄并進行單鏈RNA退火雜交后獲得dsRNA，該方法通常需要獲得價格昂貴的T7 RNA聚合酶。

微生物發酵法是目前降低dsRNA成本最可行的方法，大量RNAi實驗證實，可以利用RNase II缺陷型和DE3溶源的大腸桿菌合成dsRNA，但對其合成效率和產量研究較少。

目前，微生物源dsRNA用于生物農藥的制劑一般直接采用菌體或者細胞破碎液，沒有除雜和保護劑添加等措施，這不利于dsRNA生物制劑的生物防護效果和保存，而實驗用的較純的dsRNA制劑則需要將破碎后的細胞經過酚氯仿抽提、DNase和RNase I酶解、色譜柱純化等處理，步驟復雜，產量低。目前報道的微生物工程菌中dsRNA最高產量為6.2μg/mL。

發明內容

本發明的目的在于提供一種微生物源雙鏈RNA的快速制備方法，構建具有高表達量的表達菌株，優化大腸桿菌HT115(DE3)工程菌表達dsRNA的發酵條件，改進了工程菌發酵結束后dsRNA的分離提取和制劑方法，提高dsRNA的合成效率并進行快速提取，降低生產成本，為其在農業病蟲害防治上的大規模應用提供保障。

為了達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種微生物源雙鏈RNA的快速制備方法，包括：

1)構建表達菌株

將靶標基因插入含有T7啟動子的表達型載體，將含靶標基因的表達載體轉化至RNase III缺陷型大腸桿菌HT115(DE3)，獲得高表達dsRNA的表達菌株；

2)發酵培養