[發明專利]一種微生物源雙鏈RNA的快速制備方法

在審

• 申請號: 202110583398.6
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113151335A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 莫芹;唐雪明;呂貝貝;孫宇;吳瀟;宋麗莉
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/113;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

1.一種微生物源雙鏈RNA的快速制備方法，包括：

1)構建表達菌株

將靶標基因插入含有T7啟動子的表達型載體，將含靶標基因的表達載體轉化至RNaseIII缺陷型大腸桿菌HT115(DE3)，獲得高表達dsRNA的表達菌株；

2)發酵培養

將經過活化的含有步驟1)表達菌株的菌液加入TB液體培養基中，搖床過夜培養，將菌液轉接至新鮮的TB液體培養基，搖床培養至OD1.0-1.5后加入2.0-3.0mM IPTG誘導劑，誘導發酵17-22h后結束發酵；其中，所述TB液體培養基中均含有氨芐青霉素和四環素；

3)快速提取

發酵結束后離心獲得重組菌細胞，將其懸浮于含有NaCl的TE緩沖液中，其中NaCl濃度為0.5-1.0M，pH 7.5-8.5，物理方式破碎細胞，通過60-80℃加熱40-60min后，10000-12000rpm離心15-20min，獲得dsRNA生物制劑。

2.根據權利要求1所述的微生物源雙鏈RNA的快速制備方法，其特征在于，步驟1)中所述的靶標基因為具有黃瓜花葉病毒CMV防治作用的靶標基因。

3.根據權利要求1所述的微生物源雙鏈RNA的快速制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述物理機械設備為超聲波細胞破碎儀、高壓勻漿機或高速珠磨機。

4.根據權利要求3所述的微生物源雙鏈RNA的快速制備方法，其特征在于，利用超聲破碎儀完全破碎細胞時，將破碎細胞置于冰上，破碎方式為：破碎1s停2-3s，共20min。

5.根據權利要求3所述的微生物源雙鏈RNA的快速制備方法，其特征在于，利用高壓勻漿機完全破碎細胞時，將破碎細胞于冰上放置10-30min后進行破碎，勻漿壓力為60-80MPa，勻漿次數為1-2次。

6.根據權利要求1所述的微生物源雙鏈RNA的快速制備方法，其特征在于，所述含有T7啟動子的表達型載體為pGEM-T easy載體。

7.根據權利要求1所述的微生物源雙鏈RNA的快速制備方法，其特征在于，還包括dsRNA的定量步驟，具體為：

取上清液，加入等體積酚氯仿溶液抽提蛋白，離心后取上清，加入等體積異丙醇沉淀，離心、棄上清，沉淀用RNase-Free H₂O溶解；用DNase I特異性消化DNA，用RNase A消化單鏈RNA，加入LiCl溶液后于-20℃沉淀1-2h去除上清，沉淀用乙醇洗滌，再加入RNase-Free H₂O溶解，最后用超微量分光光度計測定dsRNA的含量。

8.根據權利要求7所述的微生物源雙鏈RNA的快速制備方法，其特征在于，在定量步驟中，RNase A消化單鏈RNA時鹽濃度大于0.3M，LiCl溶液濃度為2.5-3.0M。