[發明專利]一種利用木糖產三乙酸內酯的解脂耶氏酵母工程菌及應用

有效

• 申請號: 202110582048.8
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113403213B
• 公開（公告）日: 2022-11-18
• 發明（設計）人: 鄧利;黃曉斕;劉歡;王芳
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/81;C12P17/06;C12R1/645
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一株利用木糖生產三乙酸內酯的重組解脂耶氏酵母菌株及其應用。所述工程菌以解脂耶氏酵母為出發菌株，導入2?吡喃酮合成酶編碼基因gh2ps，同時過表達木糖還原酶編碼基因、木糖醇脫氫酶編碼基因以及木酮糖激酶編碼基因，得到重組解脂耶氏酵母工程菌。進一步優化發酵過程，開發了解脂耶氏酵母利用木糖產三乙酸內酯的最佳生產工藝，并使其產量達到目前報道搖瓶中的最高水平，產量在3g/L～6g/L之間，為后續開發廉價碳源生產高價值平臺化合物三乙酸內酯提供底盤菌株奠定了基礎。

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一株利用木糖生產三乙酸內酯的重組解脂耶氏酵母菌株及其應用。

背景技術：

三乙酸內酯是一種聯系生物轉化與化學催化的“橋梁化合物”，含有2-吡喃酮結構，可以通過水解、催化加氫等方式轉化成各種高價值中間體或終端產品，如乙酰丙酮、γ-己內酯，因此被確定為潛在的生物可再生平臺化學品，是一種有價值的商業化合物合成前體，在材料、化工等傳統領域需求量大。此外，由于三乙酸內酯具有無毒無害，低腐蝕性的特點，因此也被廣泛應用于食品、醫藥等生命健康領域。

目前，三乙酸內酯的生產方法主要包括化學合成法和生物發酵法，化學法主要是依靠石油裂解、乙酸熱解等，該法依賴化石資源，能耗大，環境污染大，生產成本高，且隨著化石能源的耗竭，三乙酸內酯價格上漲。生物法主要包括植物提取法和微生物發酵法。植物提取法主要從植物非洲雛菊中提取，該法來源少，需要占用大量的農田耕地種植，加之提取產率低，工藝復雜，不能滿足年需幾千萬噸的工業需求。因此，以天然可再生資源為原料、利用基因工程為手段、以微生物發酵為途徑生產三乙酸內酯的微生物生產法成為了當今的研究熱點。該法原料價格低廉，生產成本低，無環境污染，副產物少，開發和利用生物質能源轉化既符合我國國情，又符合可持續發展戰略。相比于大腸桿菌和釀酒酵母，解脂耶氏酵母耐受性高、環境適應能力強，具有高通量聚酮合成前體乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A代謝流，是工業化生產三乙酸內酯的優勢宿主。

木質纖維素來源于農林殘渣、廢棄物，是含量豐富、價格低廉的可再生資源，目前已有很多報道表明木質纖維素可生物轉化為有價值的產品。木糖來源于木質素降解，是木質素的主要糖成分，占木質纖維素生物量的30-40％。木糖的高效快速生物轉化是實施經濟可行的木質纖維素水解物生物轉化工藝的先決條件。目前，已有很多研究表明木糖可轉化成木糖醇、2,3-丁二醇、異丁醇聚羥基丁酸酯等生物燃料和化學品，應用前景廣闊。

解脂耶氏酵母存在完整的木糖代謝途徑，但該途徑關鍵基因在天然條件中處于沉默表達，解脂酵母不能在以木糖作為唯一碳源的培養基中自然生長，主要是由于木糖代謝途徑的三個關鍵酶木糖還原酶、木糖醇脫氫酶、木酮糖激酶的活性過低。因此需要利用基因工程手段來增強三個關鍵酶的活性，從而增強菌株的木糖代謝能力。然而，利用基因工程方法在解脂耶氏酵母中構建木糖代謝途徑來異源合成三乙酸內酯的方法還未見報道。

發明內容：

為了解決上述技術問題，本發明將通過基因工程手段構建一株能夠利用木糖的解脂耶氏酵母，并提供該菌株以木糖為碳源生產三乙酸內酯的方法。

本發明提供的技術方案之一，是一種解脂耶氏酵母基因工程菌，所述工程菌以解脂耶氏酵母為出發菌株，導入2-吡喃酮合成酶編碼基因gh2ps，同時過表達木糖還原酶編碼基因、木糖醇脫氫酶編碼基因以及木酮糖激酶編碼基因，得到重組解脂耶氏酵母工程菌；

進一步地，2-吡喃酮合成酶編碼基因、木糖還原酶編碼基因、木糖醇脫氫酶編碼基因以及木酮糖激酶編碼基因的表達方式可以是質粒表達，也可以是基因組整合表達；

優選地，所述質粒表達采用的表達載體為PYLXP’質粒；

進一步地，所述2-吡喃酮合成酶編碼基因為植物源基因，包括但不限于來源于非洲雛菊(Gerbera hybrida)的2-吡喃酮合成酶編碼基因gh2ps，核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示；