[發明專利]一種出血熱疫苗生產及純化工藝

有效

• 申請號: 202110581505.1
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113337475B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 陳韋韋;陳宣洪;周富昌;周琪;周鴻飛;周潔
• 申請（專利權）人: 羅益（無錫）生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 黃新民

本發明提供了一種出血熱疫苗生產及純化工藝，涉及疫苗生產技術領域，該出血熱疫苗生產及純化工藝包括以下步驟：細胞傳代、病毒感染、病毒液獲取、病毒液滅活、連續流離心、超濾濃縮、層析上柱以及過濾。該工藝操作簡單，生產過程穩定、副反應小，純化得到的產品純度較高。

技術領域

本發明涉及疫苗生產技術領域，具體涉及一種出血熱疫苗生產及純化工藝。

背景技術

流行性出血熱，又稱腎綜合征出血熱，是由腎綜合征出血熱病毒引起的并通過鼠類等傳播的自然疫源性急性病毒性傳染病。目前，出血熱疫苗為流行性出血熱的有效預防手段之一，出血熱疫苗主要的生產方式為轉瓶生產，但其后端純化極其困難，且純化后純度不高，雜蛋白多導致副反應較大，存在各類問題。

中國專利CN1990041A公開了一種腎綜合征出血熱VERO細胞雙價純化疫苗及其工業化生產方法，該制備方法包括：(1)分別制備腎綜合征出血熱病毒PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和L99(C-2)，CCTCC-V200504的疫苗原液，用甲醛滅活病毒；(2)將已滅活的PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和L99(C-2)，CCTCC-V200504的疫苗原液合并后純化，包括離心分離、超濾濃縮、醋酸鋅沉淀和柱層析；(3)向純化后的疫苗原液中加入佐劑，得到純化雙價疫苗。本發明制備的腎綜合征出血熱VERO細胞雙價純化疫苗，適合預防所有I型為主和II型為主的腎綜合征出血熱。該發明在培養過程中同樣也需要使用大量轉瓶，人工操作強度大。此外，上述兩項發明均使用較為常規的細胞培養液，如含8-10％的小牛血清的199或MEM，整體培養效率以及穩定度并不高，并不能為后續純化步驟提供更有效幫助。中國專利CN101732709B公開了一種多層培養瓶培養原代細胞制備出血熱疫苗的方法，步驟如下：解剖動物獲取原代細胞，將轉瓶所需細胞量的1/2或1/3細胞接種于多層細胞培養瓶內，加入適量培養液放入溫房培養，待長滿單層后接種病毒培養、收獲病毒培養液、純化后配制疫苗。但該發明使用細胞工廠，原代細胞量少、培養出的細胞量多、占用空間小、不需要轉瓶機、收率高，但細胞培養、收獲時穩態較差。

針對現有技術中出血熱疫苗生產純化時出現的人工操作難度大、技術要求高，純度不高、副反應大以及穩定性差等各類問題，亟需尋找一種操作簡單，純度高以及副反應小的生產和純化方法。

發明內容

本發明針對現有技術存在的問題，提供了一種出血熱疫苗生產及純化工藝，該工藝操作簡單，生產過程穩定、副反應小，純化得到的產品純度較高。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明提供了一種出血熱疫苗生產及純化工藝，包括以下步驟：

(1)細胞傳代：取Vero細胞使用細胞培養液復蘇培養并傳代擴增；

(2)病毒感染：對傳代擴增后的Vero細胞進行出血熱病毒感染；

(3)病毒液獲取：在出血熱病毒感染Vero細胞后進行換液，再收獲病毒液；

(4)病毒液滅活：使用滅活劑對病毒液進行病毒滅活，得到滅活病毒收獲液；

(5)連續流離心：連續流離心滅活病毒收獲液去除雜質，離心后過濾，留上清液，去除沉淀；

(6)超濾濃縮：將上清液進行超濾濃縮，得到濃縮液；

(7)層析上柱：將濃縮液上層析柱，收取第一峰的洗脫液，合并洗脫液，加入穩定劑和防腐劑，得到原液；

(8)過濾：將原液過濾后保存；

(9)配制：將出血熱病毒原液稀釋，加入保護劑和防腐劑，調節pH，混勻后除菌過濾，補加佐劑，混勻即得出血熱疫苗。

進一步地，出血熱疫苗的成品生產還包括以下步驟：