[發(fā)明專利]成人Ph-B-ALL預(yù)后相關(guān)基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110580112.9
• 申請(qǐng)日: 2021-05-26
• 公開（公告）號(hào): CN113373221A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 房秋云;秘營(yíng)昌;弓曉媛;王建祥;李艷;王君;劉凱奇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 房秋云
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 天津英揚(yáng)昊睿專利代理事務(wù)所(普通合伙) 12227
• 代理人: 吳揚(yáng)

本發(fā)明提供一種成人Ph?B?ALL預(yù)后相關(guān)基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括探針、緩沖液、雜交混合液、連接酶混合液，所述探針為13個(gè)，13個(gè)探針?lè)謩e為IKZF1、EBF1、CDKN2A/B、PAX5、ETV6、BTG1、RB1、SHOX?AREA、CRLF2、CSF2RA、IL3RA、P2RY8探針。本發(fā)明采用MLPA(P335)試劑盒，可以同時(shí)檢測(cè)13個(gè)基因缺失，無(wú)需患者大量骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本，避免患者身體受到損傷。本申請(qǐng)的MLPA(P335)試劑盒成本相對(duì)較低，技術(shù)難度低，測(cè)試時(shí)儀器要求低，應(yīng)用標(biāo)本量小，并且可以一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)多例患者的13種基因的缺失及擴(kuò)增情況，可以很好地協(xié)助臨床對(duì)成人ALL患者預(yù)后的評(píng)價(jià)，指導(dǎo)治療。概括：檢測(cè)基因全面，意義大，方便，快捷，易操作，成本低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及急性淋巴細(xì)胞白血病檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及成人 Ph^-B-ALL預(yù)后相關(guān)基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

成人急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的預(yù)后明顯差于兒童ALL，隨著兒童特點(diǎn)治療方案的應(yīng)用，成人ALL的療效有了明顯改善。但是，盡管采用同樣的方案治療，有一部分成人ALL(包括低危組)患者，預(yù)后仍然較差。成人ALL預(yù)后相關(guān)因素的研究明顯落后于成人急性髓系白血病(AML)，較常用的危險(xiǎn)因素仍以傳統(tǒng)的診斷時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、診斷分型、年齡、細(xì)胞遺傳學(xué)異常、微小殘留病等為主；而分子學(xué)異常用于預(yù)后評(píng)估缺乏共識(shí)。國(guó)際上兒童ALL的研究越來(lái)越多聚焦于一些特殊基因的分子學(xué)異常，比如IKZF1基因缺失與較差的預(yù)后相關(guān)；近期Stanulla等發(fā)現(xiàn)，IKZF1缺失常伴有其他基因缺失(如： CDKN2A/2B,PAX5，PAR1等基因)，定義并分析了IKZF1^PLUS基因異常的發(fā)生率、臨床特點(diǎn)以及患者的生存分析，提出IKZF1^PLUS基因異常與更低的EFS及更高的累計(jì)復(fù)發(fā)率相關(guān)，提示非常差的預(yù)后。我們前期曾應(yīng)用PCR或者M(jìn)LPA的方法分析我們?cè)\療中心收治的成人B-ALL患者IKZF1基因缺失的情況，并進(jìn)行了預(yù)后分析，得出 IKZF1缺失同樣預(yù)示預(yù)后較差。但I(xiàn)KZF1基因缺失發(fā)生率(不同方法學(xué))、伴發(fā)的子學(xué)異常、預(yù)后意義(尤其是不同疾病亞型的預(yù)后意義)在不同的研究報(bào)告中仍不一致。

成人急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的預(yù)后首先要進(jìn)行檢測(cè)，目前能使用的檢測(cè)手段很多，但是都存在很大缺點(diǎn)，如RNA-seq法檢測(cè)成本高，技術(shù)難度大，大多數(shù)醫(yī)院無(wú)法實(shí)現(xiàn)，并且費(fèi)用高昂加重病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；用PCR的方法檢測(cè)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)13種基因的缺失，需要多次重復(fù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟，并且需要大量的病人骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本，容易增加患者身體負(fù)擔(dān)。

發(fā)明內(nèi)容

根據(jù)以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種成人Ph^-B-ALL預(yù)后相關(guān)基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括探針、緩沖液、雜交混合液、連接酶混合液，所述探針為13個(gè)，13個(gè)探針?lè)謩e為IKZF1、EBF1、 CDKN2A、CDKN2B、PAX5、ETV6、BTG1、RB1、SHOX-AREA、 CRLF2、CSF2RA、IL3RA、P2RY8探針。

一種成人Ph^-B-ALL預(yù)后相關(guān)基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)方法，其特征在于利用MLPA技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，其具體檢測(cè)方法為：

一、標(biāo)本采集及單個(gè)核細(xì)胞的分離并提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞的DNA；

二、MLPA步驟：

(1)DNA變性：取5ul(20ng/ul)的樣品，98℃處理5min，溫度降到25℃暫停；

(2)探針與DNA的雜交：取出上述步驟的樣品，降至室溫，加入3ul 的雜交混合液，其中1.5ul SASLAS probemix、1.5ulMLPA緩沖液，然后升溫至95℃，保持1分鐘，在進(jìn)行60℃溫浴18h，得到雜交探針；

(3)進(jìn)行雜交探針的連接：

A、PCR儀降到54℃，打開管蓋；