[發明專利]一種膜蛋白的純化方法

有效

• 申請號: 202110580012.6
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113278048B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 王靜;易汪雪
• 申請（專利權）人: 武漢華美生物工程有限公司
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 丁倩

本發明公開了一種膜蛋白的純化方法，包括：誘導目的膜蛋白在宿主細胞中表達；破碎宿主細胞，490g～1000g低速離心后取上清，將上清于30000g高速離心后取沉淀；用緩沖液重懸上述沉淀，然后加入去垢劑，震蕩溶解后離心，取上清；采用親和層析純化，使用包含緩沖液、無機鹽、十二烷基?β?D?麥芽糖苷、咪唑和甘油的洗脫液進行洗脫，洗脫液超濾離心后即得目的膜蛋白。本發明針對現有的膜蛋白純化方法存在去垢劑導致膜蛋白變性，目標膜蛋白提取率低，操作復雜，成本高昂等技術問題，將低速離心和高速離心結合，并對去垢劑進行選擇，有效提高了總蛋白中目的膜蛋白的含量，即本發明提供了一種操作簡單、成本低廉、提取率高且適用性廣泛的膜蛋白純化方法。

技術領域

本發明屬于蛋白純化技術領域，具體涉及一種膜蛋白的純化方法。

背景技術

膜蛋白是生物膜功能的主要承擔者，表達量相對較低，通常是作為蛋白-脂類-去垢劑的復合物來進行純化的。這個復合物在水環境中的溶解度允許采用與水溶性蛋白質本質上相同的分離技術，區別在于：進行膜蛋白純化時需要在溶液中加入去垢劑，蛋白質-去垢劑復合物是動態的，在自由去垢劑分子不存在的情況下，去垢劑分子會立即解離下來。帶有6個組氨酸標簽的水溶性蛋白可參照標準流程直接進行純化，但帶有6個組氨酸標簽的膜蛋白與固定金屬離子親和色譜(IMAC)結合較弱，使得純化效果相比水溶性蛋白差，可能是由于去垢劑與蛋白的結合限制了組氨酸標簽與IMAC配體之間接觸。

去垢劑可分為離子型、非離子型和兩性去垢劑。離子型去垢劑包括SDS、N-月桂基肌氨酸、CTAB和膽酸鈉，能從膜中有效地提取蛋白，這些去垢劑苛刻，傾向于將蛋白變性，因為它們會破壞分子內和分子間蛋白之間的相互作用。非離子型去垢劑包括麥芽糖苷、葡萄糖苷和聚氧乙烯二醇，這類去垢劑用于膜蛋白的純化和結構研究。兩性去垢劑包括Zwittergents、Fos-Cholines、CHAPS/CHAPSO和胺氧化物，這些去垢劑像非離子型去垢劑一樣是電中性的，但通常能像離子型去垢劑一樣破壞蛋白之間相互作用，因此溫和程度介于中間。

發明內容

本發明針對現有的膜蛋白純化方法存在目標膜蛋白提取率低，操作復雜，成本高昂等技術問題，提供了一種膜蛋白的純化方法，通過將低速離心和高速離心結合，并對去垢劑進行篩選，有效提高了總蛋白中目的膜蛋白的含量，改善了膜蛋白純化過程的可操作性和高成本，即本發明提供了一種操作簡單、成本低廉、提取率高的膜蛋白純化方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

本發明提供了一種膜蛋白的純化方法，所述方法包括：

步驟1、誘導目的膜蛋白在宿主細胞中表達；

步驟2、破碎宿主細胞，490g～1000g低速離心后取上清，將上清于30000g高速離心后取沉淀；

步驟3、用重懸緩沖液重懸步驟2所得沉淀，然后加入去垢劑，震蕩溶解后離心，取上清；

步驟4、將步驟3所得上清采用親和層析純化，使用包含十二烷基-β-D-麥芽糖苷、咪唑和甘油的洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫液，超濾離心后即得目的膜蛋白。

進一步的，步驟1中，所述目的膜蛋白選自：內皮素受體B蛋白、鼠疫耶爾森菌毒力蛋白、B淋巴細胞抗原中的任意一種。

進一步的，步驟1中，所述宿主細胞為原核細胞和/或真核細胞。

進一步的，步驟2中，當宿主細胞為原核細胞時，于4℃，490g低速離心15min后取上清；當宿主細胞為真核細胞時，于4℃，1000g低速離心15min后取上清。

進一步的，步驟3中，所述去垢劑選自：體積比1：0.1的十二烷基-β-D-麥芽糖苷和膽固醇半琥珀酸三鹽；或體積比1：0.2的1-十八烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1′rac甘油)和膽固醇半琥珀酸三鹽；或體積比1：0.2的正十二烷基磷酸膽堿和膽固醇半琥珀酸三鹽。