[發明專利]一種魔芋人工種子的制備方法

有效

• 申請號: 202110579575.3
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113287521B
• 公開（公告）日: 2023-02-24
• 發明（設計）人: 張宗申;劉文;李丹丹
• 申請（專利權）人: 大連工業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/10
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了一種魔芋人工種子的制備方法。屬于藥用植物細胞工程技術領域。包括如下步驟：魔芋新球莖誘導、魔芋體細胞胚誘導、魔芋次級體細胞胚誘導、魔芋循環體細胞胚誘導、根癌農桿菌介導抗軟腐病基因aiiA轉化、人工種子制備。與現有技術相比，本發明取得的有益效果為：利用魔芋新球莖誘導循環體細胞胚，后將轉基因工程技術與人工種子制備技術結合，制備抗軟腐病魔芋人工種子，擺脫了魔芋傳統種植中軟腐病、品種退化等問題，且儲存方便，可以滿足市場需求，具有重大的推廣價值。

技術領域

本發明涉及藥用植物細胞工程技術領域，更具體的說是涉及一種魔芋人工種子的制備方法。

背景技術

魔芋又稱蒟蒻，天南星科(Araceae)魔芋屬(Amorphopha llus Blume)多年生宿根草本植物。其經濟器官是地下球莖，球莖中主要含葡甘露聚糖(KGM)、淀粉、生物堿、維生素、礦物質，此外還含有少量蛋白質、多種氨基酸、神經酰胺、黃酮類化合物等營養物質。魔芋具有多種藥理作用，主要為減肥瘦身、降脂、降血糖、抗癌、抗衰老、改善腸道微環境。并且魔芋是自然界中唯一能大量提供KGM的主要經濟作物，具有較高的醫療保健價值和經濟價值。

傳統的魔芋種植方法會受到季節和外界環境條件的限制，存在繁殖速度慢、生長周期長等問題，且隨著種植年限的延長，出現品種退化、軟腐病危害和連坐障礙危害加劇等問題，導致魔芋種植面積銳減和種質質量下降。因此魔芋產業急需良種選育。

目前關于魔芋組織培養研究，僅限于利用魔芋葉片、葉柄、塊莖等外植體誘導愈傷組織——分化成苗，實驗周期較繁瑣且僅限于實驗室研究階段；此外，愈傷組織分化成苗過程中，愈傷組織容易褐化，需要間期轉接；傳統的體細胞胚制備工藝存在體細胞胚誘導率低、工藝環節多繁瑣、成本高，體細胞胚的分化難度大；傳統制備人工種子的存在萌發率低、易失水等問題。

綜上，如何提供一種活力強、萌發率高、抗逆性強、易生根的魔芋種子制備方法是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種魔芋人工種子的制備方法。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種魔芋人工種子的制備方法，包括如下步驟：

(1)魔芋新球莖的誘導及增殖：

將魔芋分生區消毒殺菌后轉接至芽分化培養基中，25～30℃黑暗條件下培養得魔芋新球莖，之后轉接至培養基A增殖，25～30℃下黑暗培養；

所述芽分化培養基為在MS培養基中加入如下質量濃度的組分：6-BA 1.0～2.0mg/L、NAA 0.1～0.5mg/L、蔗糖3％、瓊脂0.4％；

所述培養基A為在芽分化培養基中加入0.05～0.2mg/L的KT；

(2)魔芋循環體細胞胚誘導：

將增殖的魔芋新球莖依次經魔芋體細胞胚、魔芋次級體細胞胚形成魔芋循環體細胞胚，具體為依次在IBA和2,4-D質量濃度逐漸降低的培養基中培養，培養條件均為25～30℃黑暗培養；

(3)根癌農桿菌介導抗軟腐病基因aiiA轉化：

利用含有aiiA基因的根癌農桿菌EHA105的菌液將抗軟腐病基因aiiA轉化至魔芋循環體細胞胚，得抗性循環體細胞胚；

其中含有aiiA基因的根癌農桿菌EHA105的制備方法如下：

以質粒pU1301為載體質粒，玉米Ubiquitin、CaMV35S為啟動子，用Kpnl/BamHI分別雙酶切PUC18-aiiA和雙元載體pU1301，低融點瓊脂糖法回收DNA，連接轉化后，得到植物表達載體pU1301-aiiA，經測序確認其序列準確無誤，電轉化到根癌農桿菌EHA105中。