[發明專利]一種魔芋人工種子的制備方法

有效

• 申請號: 202110579575.3
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113287521B
• 公開（公告）日: 2023-02-24
• 發明（設計）人: 張宗申;劉文;李丹丹
• 申請（專利權）人: 大連工業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/10
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

1.一種魔芋人工種子的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)魔芋新球莖的誘導及增殖：

將魔芋分生區消毒殺菌后轉接至芽分化培養基中，25～30℃黑暗條件下培養得魔芋新球莖，之后轉接至培養基A增殖，25～30℃下黑暗培養；

所述芽分化培養基為在MS培養基中加入如下質量濃度的組分：6-BA1.0～2.0mg/L、NAA0.1～0.5mg/L、蔗糖3％、瓊脂0.4％；

所述培養基A為在芽分化培養基中加入0.05～0.2mg/L的KT；

(2)魔芋循環體細胞胚誘導：

(21)將所述魔芋新球莖轉接至培養基B，在25℃、黑暗條件下誘導產生魔芋體細胞胚；

所述培養基B為在MS培養基中加入如下質量濃度的組分：IBA3.0～5.0mg/L、2,4-D1.0～2.0mg/L、蔗糖3％、活性炭0.3％、瓊脂0.4％；

(22)將所述魔芋體細胞胚轉接至培養基C，在25℃、黑暗條件下誘導產生魔芋次級體細胞胚；

所述培養基C為在MS培養基中加入如下質量濃度的組分：IBA1.0～3.0mg/L、2,4-D0.5～1.0mg/L、蔗糖3％、活性炭0.3％、瓊脂0.4％；

(23)將所述魔芋次級體細胞胚轉接至培養基D，在25℃、黑暗條件下誘導產生魔芋循環體細胞胚；

所述培養基D為在MS培養基中加入如下質量濃度的組分：IBA0.5～1.0mg/L、2,4-D0.1～0.5mg/L、蔗糖3％、活性炭0.3％、瓊脂0.4％；

(3)根癌農桿菌介導抗軟腐病基因aiiA轉化：

利用含有aiiA基因的根癌農桿菌EHA105的菌液將抗軟腐病基因aiiA轉化至魔芋循環體細胞胚，得抗性循環體細胞胚；

(4)將所述抗性循環體細胞胚制備成魔芋人工種子。

2.如權利要求1所述的一種魔芋人工種子的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述消毒殺菌的具體操作為：依次經自來水沖洗1h、無菌水浸泡30min、質量濃度75％酒精消毒20s、NaClO溶液消毒15min、無菌水沖洗3遍。

3.如權利要求1所述的一種魔芋人工種子的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)的具體操作為：

(31)將含有aiiA基因的根癌農桿菌EHA105在含有25～50mg/L卡那霉素和25～50mg/L利福平的YEB固體培養基平板劃線，25℃倒置培養2～3d后轉接至含有25mg/L卡那霉素的YEB液體培養基，25℃震蕩暗培養至菌液OD₆₀₀值為0.6～0.8；

(32)將所述菌液離心、棄上清、收集菌體，重懸液調節OD₆₀₀值為0.4～0.6，得侵染液；

(33)將魔芋循環體細胞胚浸于侵染液15～20min，吸去表面多余侵染液，轉接至共培養培養基；所述共培養培養基為在MS培養基中加入如下質量濃度的組分：IBA0.5～1.0mg/L、2,4-D0.1～0.5mg/L、蔗糖3％、乙酰丁香酮100μmol/L；

(34)將共培養后的循環體細胞胚用無菌水清洗一次、添加100～300mg/L的羧芐青霉素的無菌水清洗一次，吸干表面水分，轉接至恢復培養基，所述恢復培養基為將共培養培養基中的乙酰丁香酮替換為100～200mg/L的羧芐青霉素，之后每2周重新轉接一次，并逐步降低恢復培養基中羧芐青霉素的濃度至20～50mg/L，至魔芋循環體細胞胚恢復良好狀態，得抗性循環體細胞胚。

4.如權利要求3所述的一種魔芋人工種子的制備方法，其特征在于，步驟(31)中所述YEB固體培養基成分為酵母提取物1g/L、牛肉浸膏5g/L、蛋白胨5g/L、蔗糖5g/L、MgSO₄·7H₂O4g/L、瓊脂15g/L。

5.如權利要求3所述的一種魔芋人工種子的制備方法，其特征在于，步驟(32)中所述重懸液為在MS培養基中加入如下質量濃度的組分：IBA0.5～1.0mg/L、2,4-D0.1～0.5mg/L、蔗糖3％。