[發明專利]一種成年小鼠心房肌細胞的分離與培養方法

有效

• 申請號: 202110579178.6
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113234670B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 謝文俊;戚瑛;李晶晶;張伊;徐睿;張玉
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發明公開了一種成年小鼠心房肌細胞的分離與培養方法，本方法在心房肌細胞的不同培養階段分別利用兩種不同培養液進行培養，以增加心房肌細胞的數量與質量，在培養過程中加大了對細胞的營養與保護，大大降低了心房肌細胞的受損率。鋪板培養液的應用能夠使離體的心房肌細胞快速適應培養環境，提高細胞貼壁的效率；普通培養液則為心房肌細胞的后續培養提供具有穩定溫度、pH及充足營養的生存條件，保持其良好的生長狀態。結果表明，本發明方法能夠得到高產量與高質量的成年小鼠心房肌細胞，成本低且高效穩定，分離出的心房肌細胞數量大、活力高，能在體外繼續培養4?5天，為在細胞水平上研究成年小鼠心臟生理及病理功能提供了良好的實驗素材。

技術領域

本發明屬于細胞分離與培養技術領域，具體涉及一種成年小鼠心房肌細胞的分離與培養方法。

背景技術

心房顫動(簡稱房顫)是一種以快速、無序的心房電活動為特征的室上性心律失常，是臨床上最常見的心律失常，構成中老年人健康生活的重大威脅之一，有關房顫的發現與研究已經進行了100多年，但其發生機制卻仍未完全清楚。

心房肌細胞模型能夠排除在體激素水平等多種因素干擾，是目前研究房顫必不可少的體外實驗模型，能夠在毒性實驗、基因工程、病理模型、臨床藥物篩選等方面廣泛應用。因此，為達到在細胞及分子水平研究房顫發生發展機制的目標，首先必須獲得高產量及高質量的心房肌細胞。目前成熟穩定且使用頻繁的是針對成年大鼠心室肌細胞的分離與培養技術，最常見的是利用灌流裝置Langendorf進行主動脈逆行恒壓灌流的方法來分離。利用該方法得到的大鼠心室肌細胞狀態穩定，效果良好，并能在體外持續性培養2-3天。而哺乳動物心臟的心房壁比心室壁要薄，心房腔體積要小于心室腔，心房體積相對較小。受此生理結構的限制，大鼠的心房肌細胞在上述分離技術中不易獲得且極易受損，得到的細胞產量及質量均無法滿足體外繼續培養的條件。因此，有關心房肌細胞的分離培養技術目前仍停留在急性分離階段，這在一定程度上制約了對心房及房顫等相關疾病的研究。

小鼠(mouse)是目前研究中最常用的實驗動物品種，其以繁殖能力強、易飼養、實用經濟、基因型穩定、易于篩選等特點，常被用于建立多種轉基因動物模型。但與大鼠相比，成年小鼠因心臟體積更小、個體差異較大、消化終點不好判斷、細胞數目有限、血管管徑小、主動脈血管壁薄、主動脈插管困難等原因，使對其心房肌細胞的分離與培養技術更加難以進行，無法開展進一步的研究，阻礙了其在生命科學中的應用。

心房肌細胞屬于終末分化的細胞，一旦成熟便失去了分裂與增殖能力，所以很難將胎鼠或乳鼠心肌細胞培養的一些理論應用到成年鼠中。目前研究所用的成年小鼠心房肌細胞大多是通過急性方法獲得，直接將心房由心臟剪下，在含高鉀的酶溶液中消化分離，得到的心房肌細胞數量與質量十分有限，且無法繼續培養，并不適用于長期研究。之前許多研究者在培養液中使用濃度為10mM的BDM以維持成年小鼠心肌細胞的狀態，但得到的心肌細胞成活率在培養24h之后便急劇下降，細胞的貼附力降低，造成常規更換培養基和沖洗過程中細胞的大量丟失，大幅度降低了細胞產量。

而研究人員最近將BDM替換成一種特異性更強的細胞運動抑制劑(-)-Blebbistatin，能夠更大程度地提高心房肌細胞成活率。但由于高濃度(-)-Blebbistatin(25μM)對心肌細胞的收縮抑制效應大，換液時極難沖洗干凈，限制了隨后的細胞功能研究。除此之外，(-)-Blebbistatin造價十分昂貴，提高了分離培養技術的成本，經濟性和實用性十分有限。

發明內容

為了克服上述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種用于分離成年小鼠心房肌細胞、獲得高產量與高質量的心房肌細胞并能夠繼續培養的技術方法。

為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

本發明公開的一種成年小鼠心房肌細胞的分離與培養方法，包括以下步驟：

1)將新鮮的離體小鼠心臟清洗后移除多余組織，然后轉移至灌流系統灌注灌流緩沖液，然后灌注消化液直至心臟腫脹、顏色呈白色且表面松軟，再延長灌流2～4min；