[發明專利]一種成年小鼠心房肌細胞的分離與培養方法

有效

• 申請號: 202110579178.6
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113234670B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 謝文俊;戚瑛;李晶晶;張伊;徐睿;張玉
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

1.一種成年小鼠心房肌細胞的分離與培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）將新鮮的離體小鼠心臟清洗后移除多余組織，然后轉移至灌流系統灌注灌流緩沖液，然后灌注消化液直至心臟腫脹、顏色呈白色且表面松軟，再延長灌流2~4min；

2）將左、右心房分別剪開，置于細胞收集液中消化處理，然后將心房剪碎、吹打，直至分離成單細胞，即無組織團塊且分散均勻；

所述細胞收集液中含有牛血清白蛋白、Ⅱ型膠原酶、蛋白酶 XIV、彈性蛋白酶及CaCl₂；

3）將步驟2）處理后的心房細胞離心、棄上清后用細胞保存液吹散重懸細胞，靜置待活細胞自由沉降后，吸去上清，加入鋪板培養基，吹打重懸細胞；

4）對步驟3）處理得到的細胞進行梯度復鈣處理，然后在終濃度為1.0mM的鈣離子的鋪板培養基中存儲，得到細胞混合液；

5）用含2%小鼠層粘連蛋白的PBS溶液對玻璃片進行預孵育處理，然后移除小鼠層粘連蛋白，將步驟4）得到的細胞混合液鋪于上述預孵育處理后的玻璃片上，在37℃下孵育1~2h，添加鋪板培養基培養1h后，更換至普通培養基中常規培養，每24h換液一次，完成培養；

所述的鋪板培養基，每5mL中包含：4.2 mL的MEM，0.5 mL的Calf Serum or FBS，2.5 μL的 50 mM的 (-)-Blebbistatin，0.05 mL的 10000U/ml Penicillin-G，0.05 mL的L-Glutamine，0.1 mL的 500 mM的 BDM；0.05 mL的10% Na-ATP，0.05 mL的1M HEPES，25 μL的0.1M EGTA；

所述的普通培養基，每10mL中包含：9.3 mL的MEM，0.1 mL的10% Endotoxin-and-lipid-free BSA，0.2 mL的 500 mM BDM，5 μl 的50 mM (-)-Blebbistatin，0.1 mL的10000U/ml Penicillin, 0.1 mL的 L-Glutamine，0.1 mL的ITS，0.1 mL的1M HEPES，50 μL的0.1M EGTA。

2.根據權利要求1所述的成年小鼠心房肌細胞的分離與培養方法，其特征在于，步驟1）中，是以4 mL/min的速度持續灌注4~7min的灌流緩沖液。

3.根據權利要求1所述的成年小鼠心房肌細胞的分離與培養方法，其特征在于，步驟2）中所述消化處理是在細胞收集液中于37℃水浴加熱，持續消化15min。

4.根據權利要求1所述的成年小鼠心房肌細胞的分離與培養方法，其特征在于，步驟3）中，離心處理是以400~500 rpm的條件處理5 min。

5.根據權利要求1所述的成年小鼠心房肌細胞的分離與培養方法，其特征在于，所述梯度復鈣處理操作如下：

向重懸的細胞中加入CaCl₂儲液，混勻使溶液鈣離子濃度依次達到0.1 mM、0.2 mM、0.5mM和1.0 mM，且每個濃度至少等待3分鐘以上以待細胞適應，再加到下一個濃度。