[發明專利]煙草3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及應用

在審

• 申請號: 202110578550.1
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113278636A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 曾婉俐;李雪梅;朱保昆;向海英;楊光宇;劉欣;李晶;黃海濤;蔣佳芮;楊文武
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京維澳專利代理有限公司 11252
• 代理人: 王立民

本發明涉及一種3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及應用，3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本申請中，通過對特定煙草3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A還原酶的初步研究，發現其與煙草葉片中甾醇含量高度相關，在本氏煙草中將該基因沉默，煙草葉片中膽甾醇和豆甾醇含量發生了明顯降低，總甾醇含量降低35.4％。基于這一特性，可利用基因工程手段為煙葉品質調控、煙草新品種培育提供一定的應用基礎和參考借鑒。

技術領域

本發明屬于煙草基因工程領域，具體涉及一種煙草3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及應用。

背景技術

植物甾醇是一類重要的生理活性物質，可以調控植物生長發育，響應多種生物和非生物脅迫。煙草中甾醇類物質約占煙葉質量的0.1％～0.3％。由于甾醇的結構中含有羥基，熱解時其母體的菲環結構可形成多環芳烴，有文獻報道煙草中的甾醇是卷煙煙氣苯并芘的重要前體化合物。煙草中的甾醇類化合物主要有膽甾醇(cholesterol)、豆甾醇(stigmasterol)、菜油甾醇(campasterol)、和β-谷甾醇((β-sitosterol)，其中，豆甾醇、β-谷甾醇含量較高，菜油甾醇含量次之，膽甾醇含量最低。因此，降低煙草成熟葉片中甾醇含量可有效降低卷煙煙氣苯并芘含量。

目前植物中甾醇的合成代謝已有研究，但栽培煙草中調控甾醇合成的基因卻鮮有報道。煙草中影響甾醇含量的基因功能研究將為煙葉安全性改善、煙草品種遺傳改良提供理論支持，對提高我國煙草產品安全性具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種煙草3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及其應用，以改善煙草中甾醇含量，從而為煙葉品質調控、煙草新品種培育奠定一定基礎。

為實現上述發明目的，本申請采用如下技術方案：

一種煙草3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有1818個堿基，命名為NtHMGCR11。

進一步的，煙草3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的編碼蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由605個氨基酸殘基組成。

進一步的，煙草3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的PCR擴增制備方法，包括如下步驟：

(1)提取基因組，并反轉錄為cDNA備用；

(2)設計PCR擴增用引物，并進行PCR擴增，具體引物序列設計如下：

NtHMGCR11-F：5’-ATGGACGTTCGCCGGCGAC-3’，

NtHMGCR11-R：5’-CAACAGATATATAACAGAAGCGATC-3’。

進一步的，在步驟(1)中提取基因組時，以煙草品種紅花大金元葉片為樣品。

上述任一項的煙草3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的應用，利用基因沉默技術，通過調節煙草甾醇3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的表達量，來調節控制煙葉中甾醇含量。

進一步的，通過轉基因技術、瞬時表達技術或基因組編輯技術，構建含有煙草3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的病毒誘導沉默載體、RNAi干涉載體、超表達載體，轉化煙草，篩選獲得甾醇含量變化的煙草新品種。

具體例如：利用病毒誘導的基因沉默(VIGS)的技術，干擾煙草3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的表達使其沉默，煙草3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因沉默植株中甾醇含量顯著下降，進而獲得甾醇含量下降的植物新品種。

本發明的有益效果是：