[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)脲酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用方法

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• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113278558A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周志強;韋航;梁樹華;羅石林;盧運琨;陸迪;韋函忠;侯守海
• 申請（專利權(quán)）人: 南寧市拜歐生物工程有限責任公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12N9/80;B09C1/10;C12R1/125
• 代理公司: 北京化育知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11833
• 代理人: 秦麗

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，且公開了一種高產(chǎn)脲酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用方法，所述菌株為枯草芽孢桿菌，該菌能夠生產(chǎn)脲酶，其主要應(yīng)用于治理被重金屬污染的土壤，所述菌株是從如下方法得到：從采集的重金屬污染的土壤樣品中分離出六株枯草芽孢桿菌在37℃培養(yǎng)36h?48h后，對六株枯草芽孢桿菌進行生物量和脲酶活性的測定，得到一株脲酶減量較高、生長最佳的菌株。該高產(chǎn)脲酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用方法，與化學修復(fù)重金屬污染的土壤的方法具有成本低，本身對環(huán)境影響小，對技術(shù)及設(shè)備要求低等優(yōu)勢，與其他植物類生物修復(fù)法相比也具有周期短、見效快和耗力小的優(yōu)勢，同時降低環(huán)境污染。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種高產(chǎn)脲酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)

近些年來，國內(nèi)外眾多學者利用微生物對已經(jīng)被重金屬污染得土壤進行礦化修復(fù)實驗開展了很多研究。硫還原細菌可以通過呼吸作用使硫酸鹽作為電子受體，進而在呼吸過程中將其還原成硫化物；它還可以在同化過程中利用硫酸鹽合成氨基酸，如胱氨酸和蛋氨酸，再通過脫硫作用使S2-分泌于體外，S2-可以和重金屬形成硫化物沉淀。某些研究發(fā)現(xiàn)細菌對尿素具有分解作用，從而能夠使得重金屬離子在方解石礦物中共沉淀出來，進而能夠修復(fù)那些被重金屬污染的地下水。還有學者基于生物礦化原理，利用細菌分離底物產(chǎn)生碳酸根離子，固結(jié)重金屬離子，達到修復(fù)污染土壤的目的。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，為了更有效固結(jié)重金屬離子，最理想的狀態(tài)就是在污染體系內(nèi)部，重金屬離子附近的微區(qū)域形成大量離子CO32-。碳酸鹽礦化菌能夠在其生長過程中產(chǎn)生脲酶，并通過脲酶分解底物尿素產(chǎn)生CO32-，礦化固結(jié)環(huán)境當中的重金屬離子，使其由可提取態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檩^穩(wěn)定的碳酸鹽礦物態(tài)，降低其被植物吸收進入人類食物鏈的風險，達到修復(fù)土壤的目的。因此，實現(xiàn)碳酸鹽礦化菌在上述領(lǐng)域的規(guī)模應(yīng)用。

這種微生物修復(fù)重金屬污染土壤不僅能夠?qū)舻闹亟饘傥廴疚锟焖俳到猓蚪档椭亟饘俣拘裕材軌驕p少污染現(xiàn)場污染物的濃度，為此我們提出了一種高產(chǎn)脲酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)脲酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用方法，該菌株能夠生產(chǎn)脲酶，并且在尿素的底物作用下，能夠高效的降解土壤環(huán)境中的重金屬，還能夠相對于物理化學法修復(fù)重金屬污染土壤具有對環(huán)境影響小，費用低且對技術(shù)設(shè)備要求都低的優(yōu)點，解決了上述背景技術(shù)中所提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種高產(chǎn)脲酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用方法，所述菌株為枯草芽孢桿菌，該菌能夠生產(chǎn)脲酶，其主要應(yīng)用于治理被重金屬污染的土壤，所述菌株是從如下方法得到：從廣西南寧周邊采集的重金屬污染的土壤樣品中分離出六株枯草芽孢桿菌在37℃培養(yǎng)36 h-48h后，對六株枯草芽孢桿菌進行生物量和脲酶活性的測定，得到一株脲酶減量較高、生長最佳的菌株，命名為B-0，作為出發(fā)菌株。

將B-0進行培養(yǎng)，并且按照稀釋涂布法稀釋至105cfu/mL，取菌液0.1mL 均勻涂于無菌的空平板中，待風干后進行N+離子束注入，N+離子束注入劑量為(80、125、170、215、260)×2.6×1013N+/cm2，N+離子束注入能量為15 keV。輻照結(jié)束后用1mL無菌水洗滌細胞，按5倍稀釋法稀釋后涂入平板培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)24h，待挑取單菌落，搖瓶檢測，篩選出其中脲酶活性最強且生長最佳的那一株菌株，命名為枯草芽孢桿菌S-1。

優(yōu)選的，所述的枯草芽孢桿菌S-1培養(yǎng)條件為碳源為葡萄糖；氮源為酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨等材料；生長的最適溫度范圍為30～42℃， pH為6.5～8.0，培養(yǎng)過程中可添加磷酸二氫銨、氯化鈣、硫酸鎂等。

優(yōu)選的，所述的枯草芽孢桿菌優(yōu)化發(fā)酵，固化重金屬的應(yīng)用。包括如下步驟：

1)種子培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度30～42℃，培養(yǎng)時間24～60h。