[發明專利]檢測番茄環斑病毒的引物組合物、試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202110576568.8
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113293232A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 楊倩倩;王道;張蓬軍;俞曉平;劉光富;許益鵬;郝培應
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了檢測番茄環斑病毒的引物組合物、試劑盒及應用。所述引物組合物由引物ToBF1、引物ToBR1、引物ToDR1、引物ToMBR1和引物ToCPF1組成；本發明設計并篩選了具有高特異性的檢測番茄環斑病毒的CPA引物組合物，建立了CPA的檢測方法并提供了番茄環斑病毒的檢測試劑盒。本發明提供的試劑盒和方法更快速、準確，特異性好，靈敏度高，實時熒光檢測方法最低可以檢測到濃度為5×10^?2ng/μL的番茄環斑病毒總RNA，核酸檢測試紙條方法最低可以檢測到濃度為0.5ng/μL的番茄環斑病毒總RNA。非常適用于醫療衛生、食品安全以及進出口檢疫的現場檢測，易于大范圍推廣應用。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及檢測番茄環斑病毒的引物組合物、試劑盒及應用。具體涉及一種大豆種傳檢疫性病毒番茄環斑病毒的交叉引物、基于交叉引物等溫擴增技術快速檢測番茄環斑病毒的方法、試劑盒及其應用。

背景技術

番茄環斑病毒(Tomato ringspot virus，ToRSV)是伴生豇豆病毒科(Secoviridae)，豇豆花葉病毒亞科(Comovirinae)，線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)成員。ToRSV是單鏈RNA病毒，病毒粒子為等軸對稱球狀20面體，直徑為28nm，無包膜，致死溫度約58℃。ToRSV可侵染葡萄、天竺葵、番茄、大豆、蘋果、杏、櫻桃和煙草等重要經濟作物，受其侵染的煙草、天竺葵、懸鉤子上均表現花葉和環斑，葡萄上以黃脈為主，表現黃化、斑駁、褪綠環斑等癥狀，桃樹和李屬其他種上會產生莖溝病。ToRSV在遠距離傳播擴增主要通過種子傳毒的途徑，種子傳毒率因不同植物而異，如大豆76％、千日紅76％、蒲公英24％。ToRSV目前主要分布于北美溫帶地區，如加拿大、美國等，在亞洲和歐洲各地也均有報道。ToRSV的寄主廣泛，其傳播迅速，且適應性強危害嚴重，目前我國已將其列入植物進境檢疫性有害生物名錄，并將其列為禁止進境危險性病毒。

目前，番茄環斑病毒的檢測方法主要包括ELISA、RT-PCR和實時熒光RT-PCR等檢測方法。但這些方法都存在局限性，ELISA方法靈敏度低，難以實現無癥狀植物中少量病毒的檢測，且ELISA方法常常無法鑒別病毒種類，特異性差；而基于PCR技術的檢測方法存在反應時間長、需要昂貴的熱循環儀器和專業的操作人員等缺陷，難以滿足口岸檢疫的快速檢測的需求。

交叉引物等溫擴增(Cross-priming isothermal amplification，CPA)是杭州優思達生物技術有限公司研發的核酸體外擴增技術，也是中國首個具有自主知識產權的核酸擴增技術。根據反應體系中交叉引物數量的不同，CPA可分為單交叉CPA(single crossingCPA)和雙交叉CPA(double crossing CPA)兩種類型。單交叉CPA是在對雙交叉CPA機制優化后誕生的，其能夠在不到一小時的時間內擴增出4個基因組DNA拷貝，具有高度的特異性，也是目前被廣泛應用的交叉引物等溫擴增技術。CPA擴增體系主要包括交叉引物、剝離引物、以及具有鏈置換功能的DNA聚合酶等，在63℃左右水浴鍋內1h即可得到大量單雙鏈產物，沒有昂貴儀器的限制，操作簡單，結合核酸試紙條可實現擴增產物的可視化檢測，快速得到檢測結果。鑒于此，開發一種快速、特異、靈敏、而又方便穩定的分子檢測方法，可為番茄環斑病毒的進口檢疫提供可靠、有效的技術保障，具有重要的經濟意義和社會意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何更快速、特異、靈敏、方便地檢測番茄環斑病毒(Tomato ringspot virus)。所要解決的技術問題不限于如所描述的技術主題，本領域技術人員通過以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術主題。