[發明專利]一種MALDI TOF-MS檢測生殖道病原體的核酸指紋圖譜庫的制備方法

有效

• 申請號: 202110576512.2
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113355456B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 李維;鄔文燕;張雪蓮;張海燕;馬慶偉
• 申請（專利權）人: 北京毅新博創生物科技有限公司;重慶市急救醫療中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/689;C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/6806;C12Q1/14;C12Q1/04;C12N15/11
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1.一種MALDI TOF-MS檢測生殖道病原體的核酸指紋圖譜庫的制備方法，步驟包括：

(1)針對10種病原體的目的片段設計引物，并把這些片段連接到質粒載體上進行轉化，合成了分別包含該10個目的片段的10個質粒，其中，

金黃色葡萄球菌的nuc目的片段的特異性引物組為：SEQ1和SEQ2；

B族鏈球菌的scpB片段目的片段的特異性引物組為：SEQ3和SEQ4；

淋病奈瑟菌的NG片段目的片段的特異性引物組為：SEQ5和SEQ6；

陰道加德納菌的16sRNA片段目的片段的特異性引物組為：SEQ7和SEQ8；

白色念珠菌的ITS片段目的片段的特異性引物組為：SEQ9和SEQ10；

生殖支原體的PA片段目的片段的特異性引物組為：SEQ11和SEQ12；

解脲支原體的UreA片段目的片段的特異性引物組為：SEQ13和SEQ14；

沙眼衣原體的PmpF片段目的片段的特異性引物組為：SEQ15和SEQ16；

HPV16的L1片段目的片段的特異性引物組為：SEQ17和SEQ18；

HPV18的L1片段目的片段的特異性引物組為：SEQ19和SEQ20；

(2)提取10種質粒的混合DNA，并用步驟(1)中的引物組對上述混合DNA進行多重擴增，同時設置空白對照和陰性對照；

(3)對多重PCR產物進行純化；

(4)加入單堿基延伸引物和延伸反應液，對擴增產物進行單堿基延伸，其中，

金黃色葡萄球菌的nuc目的片段的延伸引物為：SEQ21，其擴增片段長度為138bp，擴增片段特征峰值為6077m/z；

B族鏈球菌的scpB片段目的片段的延伸引物為：SEQ22，其擴增片段長度為121bp，擴增片段特征峰值為5447.6m/z；

淋病奈瑟菌的NG片段目的片段的延伸引物為：SEQ23，其擴增片段長度為142bp，擴增片段特征峰值為5288.3m/z；

陰道加德納菌的16sRNA片段目的片段的延伸引物為：SEQ24，其擴增片段長度為111bp，擴增片段特征峰值為5919.8m/z；

白色念珠菌的ITS片段目的片段的延伸引物為：SEQ25，其擴增片段長度為156bp，擴增片段特征峰值為6363.2m/z；

生殖支原體的PA片段目的片段的延伸引物為：SEQ26，其擴增片段長度為135bp，擴增片段特征峰值為6694.4m/z；

解脲支原體的UreA片段目的片段的延伸引物為：SEQ27，其擴增片段長度為128bp，擴增片段特征峰值為5997.9m/z；

沙眼衣原體的PmpF片段目的片段的延伸引物為：SEQ28，其擴增片段長度為118bp，擴增片段特征峰值為6986.6m/z；

HPV16的L1片段目的片段的延伸引物為：SEQ29，其擴增片段長度為145bp，擴增片段特征峰值為8241.3m/z；

HPV18的L1片段目的片段的延伸引物為：SEQ30，其擴增片段長度為122bp，擴增片段特征峰值為5424.6m/z；

(5)將延伸引物擴增片段產物直接與基質形成結晶混合物，點樣于同一張芯片上；

(6)質譜儀檢測，得到含有10種目的片段的特征核酸指紋圖譜；

(7)將步驟(6)得到的核酸指紋特征圖譜，通過計算機軟件與空白對照、陰性對照、陽性對照進行比對分析，得到10種生殖道病原體的標準核酸指紋特征圖譜。

2.權利要求1的方法，其中所述DNA吸附柱的固相支持物包括凝膠、樹脂、硅土、硅膠、磁珠、玻璃粉或玻璃珠。

3.權利要求2的方法，其中所述基質為含有酸性成分的復合基質，該酸性成分包括甲酸、乙酸或檸檬酸。

4.權利要求3的方法，其中所述芯片為飛行時間質譜專用微陣列芯片，其材質包括不銹鋼、金剛石、單晶硅或石英晶體。

5.權利要求1-4任一項的方法，其中步驟(2)中利用NanoDrop ND-2000核酸檢測儀測量質粒DNA的濃度，確定DNA的拷貝數作為敏感度的標準品定量母液。