[發(fā)明專利]基于DNA納米線的局域催化發(fā)夾自組裝技術(shù)檢測(cè)外泌體miRNA的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110575085.6
• 申請(qǐng)日: 2021-05-25
• 公開（公告）號(hào): CN113388668A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭磊;張曄;羅世華;巫媛;司徒博;張曉荷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6841
• 分類號(hào): C12Q1/6841;C12Q1/682;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 張博

本發(fā)明公開了一種基于DNA納米線的局域催化發(fā)夾自組裝技術(shù)檢測(cè)外泌體miRNA的方法，采用DNA納米線?CHA熒光探針，所述熒光探針包括Trigger、L1、L2及H1、H2，其中H1帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)；靶標(biāo)miRNA存在時(shí)啟動(dòng)CHA反應(yīng)，打開DNA四面體上的H1發(fā)夾結(jié)構(gòu)，H1暴露出來的“立足點(diǎn)”片段繼續(xù)打開H2的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在納米線上形成H1/H2雙鏈復(fù)合體并將H1上的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開，從而發(fā)出熒光信號(hào)，檢測(cè)熒光值即可對(duì)靶標(biāo)miRNA定量分析。本發(fā)明是一種能與外泌體進(jìn)行快速、靈敏、特異、高效反應(yīng)的信號(hào)放大技術(shù)，能夠原位檢測(cè)外泌體中特異miRNA。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于DNA納米線的局域催化發(fā)夾自組裝技術(shù)檢測(cè)外泌體miRNA的方法。

背景技術(shù)

外泌體(exosome)是由細(xì)胞內(nèi)多泡小體通過細(xì)胞質(zhì)膜融合向細(xì)胞外環(huán)境釋放并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的直徑在30-150nm之間的具有脂質(zhì)雙分子層的膜性囊泡。循環(huán)外泌體通過將特定的生物活性分子(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等)從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，參與多種病理生理過程。最新研究證明exosome與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及免疫應(yīng)答具有相關(guān)性，是一類具有廣泛應(yīng)用前景的新型生物標(biāo)志物。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類介導(dǎo)mRNA翻譯的18-25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA。研究表明，miRNA的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系，且在腫瘤組織中具有能夠區(qū)別于正常組織的miRNA表達(dá)譜。另一方面，大量的研究已經(jīng)證實(shí)在各種腫瘤細(xì)胞分泌的exosome中存在異常表達(dá)miRNA(exo-miRNA)分子，如miRNA-21與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；miRNA-375可用于診斷乳腺癌；let-7可以作為卵巢癌的標(biāo)志物等。因此，exosome中特異miRNA分子可以作為早期無創(chuàng)檢測(cè)癌癥和預(yù)后評(píng)估的可靠生物標(biāo)記物。而且，外泌體富含膽固醇的膜可以保護(hù)miRNA在體內(nèi)循環(huán)時(shí)不被RNA酶降解，這為exosome內(nèi)miRNA作為腫瘤標(biāo)志物提供了強(qiáng)有力的保障。

目前外泌體miRNA(exo-miRNA)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要包括exosome分離和miRNA分析兩大步驟。超速離心法是分離exosome的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)長(zhǎng)、需要昂貴的儀器設(shè)備、樣本量大(＞2m1)等缺點(diǎn)限制了其臨床應(yīng)用。已出現(xiàn)的商品化exosome磁珠分離和沉淀試劑盒耗時(shí)較短，操作簡(jiǎn)便，所需標(biāo)本量少，但分離純度不足。miRNA分析的經(jīng)典方法：Northern印跡雜交、微陣列技術(shù)、RT-PCR等用于檢測(cè)exo-miRNA時(shí)具有以下的挑戰(zhàn)：(1)在分析前，需要裂解大量的exosome提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成對(duì)應(yīng)的cDNA，這是繁瑣和耗時(shí)的過程；(2)早期癌癥中，exosome中特異性的miRNA表達(dá)量低，檢測(cè)分析過程中容易受到exosome中其他核酸產(chǎn)生的大量背景信號(hào)的干擾，有效量化exo-miRNA仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。近年來，原位檢測(cè)exo-miRNA的研究吸引了越來越多的關(guān)注。有研究者將陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹分子信標(biāo)(MBs)原位檢測(cè)外泌體miRNA，也有研究者構(gòu)建了“gold nanoflares”探針(帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA序列的金納米顆粒)，該探針通過共孵育進(jìn)入exosome與靶miRNA結(jié)合產(chǎn)生熒光報(bào)告信號(hào)，最后用熒光光譜儀進(jìn)行定量分析。但無論nanoflares還是MBs只能以等量反應(yīng)比與靶miRNA雜交，不存在信號(hào)擴(kuò)增。因此，迫切需要開發(fā)一種能與exosome進(jìn)行快速、靈敏、高效反應(yīng)的信號(hào)放大技術(shù)，原位檢測(cè)外泌體中特異miRNA。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種基于DNA納米線的局域催化發(fā)夾自組裝技術(shù)檢測(cè)外泌體miRNA的方法，是一種能與外泌體(exosome)進(jìn)行快速、靈敏、高效反應(yīng)的信號(hào)放大技術(shù)，能夠原位檢測(cè)外泌體中特異miRNA。