[發(fā)明專利]托品酮生物合成融合蛋白及其應(yīng)用和方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110572747.4
• 申請(qǐng)日: 2021-05-25
• 公開（公告）號(hào): CN113307884B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾俊嵐;廖志華;邱飛;劉雪超;陳敏;楊春賢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12P17/18
• 代理公司: 重慶航圖知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

本發(fā)明公開了托品酮生物合成融合蛋白及其應(yīng)用和方法，托品酮生物合成融合蛋白由III型聚酮合酶PYKS和托品酮合成酶CYP82M3通過連接肽連接，所述III型聚酮合酶PYKS位于連接肽的羧基端，所述托品酮合成酶CYP82M3位于連接肽的氨基端；本發(fā)明利用PYKS與CYP82M3融合表達(dá)后發(fā)生相互作用，構(gòu)成托品酮的代謝區(qū)室，經(jīng)表達(dá)后提高了托品酮的合成效率，其效果優(yōu)于PYKS和CYP82M3進(jìn)行雙基因共表達(dá)，或CYP82M3位于連接肽的羧基端的融合蛋白，因此該融合蛋白可用于提高托品烷生物堿合成能力，對(duì)托品烷生物堿的生產(chǎn)具有非常重要的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及代謝工程領(lǐng)域，具體涉及托品酮生物合成融合蛋白，還涉及托品酮生物合成融合蛋白的應(yīng)用和提高托品烷生物堿的方法。

背景技術(shù)

托品烷生物堿(Tropane Alkaloid，TA)是一類具有重大醫(yī)療價(jià)值的天然抗膽堿藥物，廣泛用于麻醉、鎮(zhèn)痛、止咳、平喘和抗暈動(dòng)病，也用于控制帕金森病的僵直和震顫。臨床上常用的是莨菪堿(hyoscyamine)和東莨菪堿(scopolamine)，市場(chǎng)需求十分巨大。目前TA都是從少數(shù)茄科TA資源植物中提取，包括顛茄(Atropa belladonna)、曼陀羅(Daturastramonium)和莨菪(Hyoscyamus niger)，顛茄是莨菪堿和東莨菪堿最主要的商業(yè)栽培藥源，也是藥典收錄的TA藥源植物。野生顛茄植株中莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02％～0.17％(干重)，東莨菪堿含量?jī)H為干重的0.01％～0.08％。因此，培育托品烷生物堿高產(chǎn)藥用植物一直是該行業(yè)長(zhǎng)期追求的目標(biāo)。此外，酵母合成生物學(xué)的發(fā)展為托品烷生物堿藥用資源短缺提供了一種可能的解決方案，但目前TA全合成酵母菌株中，莨菪堿產(chǎn)量最高為80μg.L^-1，東莨菪堿產(chǎn)量最高為30μg.L^-1，遠(yuǎn)低于商業(yè)生產(chǎn)需求。

托品酮是莨菪堿和東莨菪堿等藥用托品烷生物堿生物合成的必需前體。鳥氨酸經(jīng)多步酶促反應(yīng)合成N-甲基吡咯啉。N-甲基吡咯啉在III型聚酮合酶PYKS的催化下合成4-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)-3-oxobutanoic acid，再被托品酮合成酶CYP82M3進(jìn)一步催化合成托品酮。托品酮再經(jīng)多步酶促反應(yīng)合成莨菪堿和東莨菪堿等藥用托品烷生物堿。已有研究表明，無(wú)論在植物代謝工程或是酵母合成生物學(xué)中，托品酮生物合成均是托品烷生物堿生物合成的關(guān)鍵限速步驟，極大地限制了下游藥用托品烷生物堿的積累。因此，通過生物技術(shù)優(yōu)化改造托品酮的生物合成步驟對(duì)藥用托品烷生物堿的生產(chǎn)具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種托品酮生物合成融合蛋白；本發(fā)明的目的之二在于提供所述托品酮生物合成融合蛋白在提高托品烷生物堿合成能力中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之三在于提供提高托品烷生物堿合成能力的核苷酸；本發(fā)明的目的之四在于提供提高托品烷生物堿合成能力的表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之五在于提供一種提高托品烷生物堿合成能力的宿主細(xì)胞；本發(fā)明的目的之六在于提供提高托品烷生物堿含量的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、托品酮生物合成融合蛋白，所述托品酮生物合成融合蛋白由III型聚酮合酶PYKS和托品酮合成酶CYP82M3通過連接肽連接，所述III型聚酮合酶PYKS位于連接肽的羧基端，所述托品酮合成酶CYP82M3位于連接肽的氨基端。

優(yōu)選的，所述III型聚酮合酶PYKS為植物III型聚酮合酶或細(xì)菌類III型聚酮合酶，具有催化N-甲基吡咯啉合成4-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)-3-oxobutanoic acid的能力，托品酮合成酶CYP82M3來(lái)源于植物或細(xì)菌，可以催化4-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)-3-oxobutanoic acid合成托品酮即可。

本發(fā)明中，所述連接肽可以為任何連接肽，可以將述III型聚酮合酶PYKS位于羧基端，托品酮合成酶CYP82M3位于氨基端均可實(shí)施，優(yōu)選的，所述連接肽為3xGGGGS，2xGGGGS或GGSGGGGG。