[發明專利]靶向敲除ARID1A基因的sgRNA、構建ARID1A基因缺失細胞株的方法及應用

在審

• 申請號: 202110572641.4
• 申請日: 2021-05-25
• 公開（公告）號: CN113308470A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 劉希;廉潔;汪園園;鄧元;李曉鋒;張冠軍
• 申請（專利權）人: 西安交通大學醫學院第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10;A61K31/7105;A61P35/00
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發明公開了靶向敲除ARID1A基因的sgRNA、構建ARID1A基因缺失細胞株的方法及應用，屬于生物醫藥技術領域。通過構建重組慢病毒質粒ARID1A sgRNA?lentiCRISPR v2、將CRISPR/Cas9慢病毒系統通過293T細胞進行包裝獲得慢病毒顆粒、將慢病毒顆粒感染目的細胞株、有限稀釋法傳代篩選，可獲得穩定的ARID1A基因敲除的細胞株。Western blot蛋白表達檢測顯示，基因敲除的細胞株ARID1A蛋白表達完全缺失。另外，ARID1A基因敲除的細胞株增殖能力明顯增強。結果表明，利用CRISPR/Cas9慢病毒系統成功敲除ARID1A基因后，可促使胃上皮細胞的惡性轉化。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種敲除ARID1A基因的sgRNA、構建ARID1A基因缺失細胞株的方法及應用。

背景技術

ARID1A(AT-rich interactive domain-containing protein 1A)基因位于人第1號染色體1p35.3，長約86kb，包含20個外顯子，編碼一個定位于細胞核、相對分子量約為240kDa的蛋白。ARID1A蛋白是SWI/SNF染色質重塑復合物的重要組成亞基，參與染色質重塑，如DNA的復制、轉錄和損傷修復等過程，是細胞核活動的關鍵成員，調控基因的表達。新近研究發現，染色質重塑復合物分子基因型的改變是腫瘤發生發展的新機制。ARID1A突變缺失導致的染色質重塑異常進而引起基因表達調節紊亂，與多種腫瘤的發生發展密切相關?；蚪M測序研究顯示：在胃癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均存在高頻的ARID1A突變。但ARID1A突變缺失后，促進腫瘤發生發展的具體分子機制尚未明確。

胃癌位居世界惡性腫瘤發病率的第五位，死亡率的第三位。晚期胃癌患者五年生存率低于30％，而目前仍缺乏有效的治療方案。因此，深入研究胃癌發生發展的分子機制，對探索胃癌診治的新靶點、促進精準醫療具有重要意義。

既往研究多采用RNA干擾技術研究胃癌相關基因。然而，RNA干擾只能低效率的敲低基因的表達，并不能實現基因的突變缺失，限制了ARID1A突變缺失在胃癌中的分子機制的研究。

CRISPR/Cas9系統是細菌和古生菌等原核生物在進化過程中，抵抗噬菌體或質粒等外源DNA入侵的一種獲得性免疫防御系統，也是一種由RNA介導的核酸內切酶系統。經過人工改造后，Cas9蛋白可在與靶向序列互補的sgRNA的引導下，定位到基因組與PAM序列相鄰的靶向序列進行剪切導致DSBs，通過NHEJ或HDR修復機制引入突變或新的基因，實現對真核細胞高效的、特異的基因編輯。CRISPR/Cas9基因編輯系統靶向位點選擇靈活、效率高、載體構建方法簡單，是近年來基因編輯領域的重大研究突破和研究熱點。

采用該系統進行特定基因的精準敲除、構建基因突變缺失細胞株，關鍵之處為sgRNA的設計。在sgRNA設計時，需注意位置、序列、特異性評分、有效性、脫靶等眾多參數，才能提高sgRNA的打靶效率。當前國內尚未見研究報道與胃癌相關的ARID1A基因敲除的sgRNA設計，因此，通過設計ARID1A基因敲除的sgRNA，構建能在體外長期培養的ARID1A突變缺失的穩定人胃上皮細胞株，在探索胃癌發生新機制和新診治靶點中具有重要的研究和應用價值。

發明內容

為了克服上述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種敲除ARID1A基因的sgRNA、構建ARID1A基因缺失細胞株的方法及應用。

為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

本發明公開了用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA，所述sgRNA為Exon2-sgRNA或Exon3-sgRNA；其中，Exon2-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，Exon3-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發明還公開了一種CRISPR/Cas9質粒，含有上述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA。