[發明專利]靶向敲除ARID1A基因的sgRNA、構建ARID1A基因缺失細胞株的方法及應用

在審

• 申請號: 202110572641.4
• 申請日: 2021-05-25
• 公開（公告）號: CN113308470A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 劉希;廉潔;汪園園;鄧元;李曉鋒;張冠軍
• 申請（專利權）人: 西安交通大學醫學院第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10;A61K31/7105;A61P35/00
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

1.用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA為Exon2-sgRNA或Exon3-sgRNA，Exon2-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，Exon3-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一種CRISPR/Cas9質粒，其特征在于，含有權利要求1所述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA。

3.一種CRISPR/Cas9慢病毒系統，其特征在于，利用權利要求1所述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA構建而成。

4.權利要求3所述的CRISPR/Cas9慢病毒系統的構建方法，其特征在于，包括：

1)使用BsmBI酶切CRISPR/Cas9慢病毒載體LentiCRISPRV2，得到酶切后線性化的CRISPR/Cas9慢病毒載體；

2)利用權要求1所述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA序列，在其5'端添加CACC得到正向寡核苷酸鏈，在用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA序列的互補鏈的5'端添加AAAC得到反向寡核苷酸鏈；

3)將步驟2)獲得的正向寡核苷酸鏈、反向寡核苷酸鏈磷酸化和退火形成雙鏈，然后與步驟1)獲得的線性化的CRISPR/Cas9慢病毒載體連接，轉化挑單克隆菌株，提取重組質粒，獲得靶向敲除人ARID1A基因的CRISPR/Cas9慢病毒系統。

5.一種慢病毒顆粒，其特征在于，利用權利要求3所述的CRISPR/Cas9慢病毒系統用細胞包裝獲得。

6.一種試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA，和/或權利要求2所述的CRISPR/Cas9質粒，和/或權利要求3所述的CRISPR/Cas9慢病毒系統，和/或權利要求5所述的慢病毒顆粒。

7.權利要求1所述的用于靶向敲除人ARID1A基因的sgRNA、權利要求2所述的CRISPR/Cas9質粒、權利要求3所述的CRISPR/Cas9慢病毒系統和/或權利要求5所述的慢病毒顆粒在制備治療胃癌的藥物和/或制劑中的用途。

8.一種ARID1A基因缺失的細胞株，其特征在于，利用權利要求3所述的CRISPR/Cas9慢病毒系統轉染目的細胞株后獲得。

9.權利要求8所述的ARID1A基因缺失的細胞株的制備方法，其特征在于，包括：

1)將所述CRISPR/Cas9慢病毒系統通過293T細胞進行包裝，得到慢病毒顆粒；

2)將慢病毒顆粒感染目的細胞株，有限稀釋法傳代篩選，獲得ARID1A基因缺失的細胞株。

10.如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述目的細胞株為人胃上皮永生化細胞株GES-1。