[發明專利]鑒定或輔助鑒定淡水魚類物種的PCR引物、試劑或試劑盒和鑒定方法

在審

• 申請號: 202110572002.8
• 申請日: 2021-05-25
• 公開（公告）號: CN113564262A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 胡文靜;蘇超群;張真;劉其根;胡忠軍
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學;信陽農林學院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 張潔

本發明提供了一種新的鑒定或輔助鑒定淡水魚類物種的PCR引物(16s 200)，所述引物的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID NO.1。該PCR引物用于魚類線粒體DNA序列的eDNA代謝編碼。采用該PCR引物對水體中的eDNA進行PCR擴增，基于高通量測序方法，能夠有效的解決水體中存在多種近緣物種條件下難以得到有效的物種特異性引物的問題，基于環境DNA監測技術，為魚類分類學研究及其多樣性保護提供有效的技術支撐。利用該PCR引物鑒定淡水魚類物種的方法具有耗時短、操作簡便、特異性強等優點。

技術領域

本發明涉及鑒定或輔助鑒定淡水魚類物種的PCR引物、試劑或試劑盒和鑒定方法，屬于分子生態學領域。

背景技術

由于環境變化和人類活動，全球生物多樣性正在迅速減少。淡水生態系統是地球上最脆弱的生態系統之一，淡水魚類是淡水生態系統的重要組成部分，由于氣候變化、生境退化、生物入侵和過度捕撈等因素影響，淡水魚類多樣性正在迅速減少。準確評估魚類種群和水生群落對環境變化的反應并量化魚類群落結構和功能變化對水生生態系統的影響能力對于保護淡水生態系統和魚類多樣性至關重要。傳統的魚類監測技術，主要利用網具、釣具、電漁具、通過潛水等方式在現場采集實體標本，這種破壞性采樣的缺點顯而易見：對于珍稀物種、低密度的物種特別是外來入侵種的早期以及分布于復雜危險生境的魚類，采樣較為困難、甚至不具可操作性，且這些方法往往耗時費力，可能會傷害到目標物種或者破壞調查點的生態系統。

魚類監測的另一類常用技術是聲學探測法，該方法利用回聲探測儀對各個水體的魚類資源狀況進行評估。研究通過回聲成像，并充分結合分層拖網的魚類取樣，進行積分分配，從而得到目標強度與魚體長度的換算關系式，最后估算水域魚類資源量及分布，其結果相對捕撈法能更好地了解魚類的數量和分布。然而該技術既不能對不同魚類進行分類，同時準確的定量，還需建立在有正確的捕撈模型的基礎上，目前的漁探儀均以國外海洋魚類為標準建模，其是否適合我國的淡水魚類存在著較大的疑問，該技術還受到水域理化指標和天氣狀況的限制。近年來，環境DNA(EnvironmentalDNA，eDNA)監測技術因其分子生物學手段的鑒定準確、對目標生物不造成干擾和樣品采集的便利等優勢，引起了廣大水生生物研究人員的關注。

環境DNA是指從有機體脫落釋放進入到自然環境中(如空氣、水、土壤等)的DNA，包括細胞中的DNA和細胞破碎后游離出細胞外的DNA分子。在近些年來，環境DNA監測技術因其高效性、對目標生物不造成干擾和樣品采集的便利等優勢，引起了廣大水生生物研究人員的關注。環境DNA監測技術的優勢主要包括：(1)調查靈敏度高；(2)采樣便利； (3)環境友好、對調查對象無損傷；(4)省時省力，調查成本低；(5)采樣時間受天氣等自然因素的影響更小。環境DNA監測技術在大型水生生物上的運用源自2008年Ficetola對美國牛蛙的探測研究，自此，環境DNA監測技術對水生生物的定性探測研究便開展起來，并在外來魚類入侵監測、稀有魚類物種的檢測和魚類群落資源調查等方面取得了良好的效果驗證。比如，利用水樣eDNA分析法監測密歇根湖及其周邊河流中鏈和鳙的擴散趨勢，利用水樣eDNA分析法分析追蹤入侵物種藍鰓太陽魚在日本本土及周邊島嶼的擴散趨勢等等，均取得了優于傳統觀察法的監測效果。Miya等通過對多個海洋魚類物種的線粒體序列進行分析，設計出適用于海洋魚類的通用引物，并與高通量測序技術相結合，驗證了其在環境DNA 監測方法上的可行性。然而，在隨后的研究中發現，國外研究人員設計的淡水魚類通用引物在國內環境使用時效果并不理想，其原因在于我國淡水常見魚類以鯉科魚類為主，魚類物種間親緣關系相對較近，而使用國外設計的魚類通用引物進行擴增對比時，部分魚類的擴增片段序列相同，無法達到鑒定的準確性。因此，目前國內在利用淡水魚類通用引物進行實驗時無法同時兼顧精度和廣度。

發明內容