[發(fā)明專利]豆蔻酰化四肽的分子印跡整體柱及制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110568394.0
• 申請日: 2021-05-25
• 公開（公告）號: CN113262768B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發(fā)明（設計）人: 劉照勝;郝文靜;黃艷萍
• 申請（專利權）人: 天津醫(yī)科大學
• 主分類號: B01J20/26
• 分類號: B01J20/26;B01J20/281;B01J20/30;B01D15/22;G01N33/68
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 趙尊生

本發(fā)明涉及一種豆蔻酰化四肽的分子印跡整體柱及制備方法和應用，具體為一種基于共價印跡及印跡后修飾方法制備豆蔻酰化四肽的分子印跡整體柱。以豆蔻酰化四肽為模板，利用功能單體4?烯丙氧基苯甲醛中的醛基與模板分子中的氨基發(fā)生共價反應形成席夫堿的特點得到模板?功能單體復合物，除去模板分子后，再利用氫氧化鈉的歧化作用使醛基發(fā)生歧化反應變成羥基和羧基，得到印跡后修飾的分子印跡整體柱。該方法簡便易行，可提高印跡整體柱的富集效果，對于豆蔻酰化蛋白組學的研究具有重要的研究意義。

技術領域

本發(fā)明涉及一種豆蔻酰化四肽的分子印跡整體柱及制備方法和應用，具體為一種基于共價印跡及印跡后修飾方法制備豆蔻酰化四肽的分子印跡整體柱。以豆蔻酰化四肽（Myristoylated tetrapeptide）為模板，利用共價印跡方法合成新型印跡整體柱，并通過印跡后修飾方法對整體柱進行后處理，解決了模板與功能單體再結合困難的問題，而且提高了印跡整體柱的富集效果，增強了豆蔻酰化修飾的多肽鑒定能力，在修飾蛋白組學領域有良好的應用前景。

背景技術

蛋白質(zhì)N-豆蔻酰化修飾是由豆蔻酰化轉移酶介導的，在蛋白質(zhì)N端甘氨酸上共價連接上14-碳飽和脂肪酸的一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。其首次發(fā)現(xiàn)是在1982年，cAMP依賴性蛋白激酶的N端被豆蔻酰化，目前已確定了100多種豆蔻酰化蛋白質(zhì)，包括絲氨酸/蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶、激酶底物蛋白、磷酸酯酶和參與信號傳導的其他蛋白，主要參與細胞生長發(fā)育、信號傳導、腫瘤發(fā)生及病毒復制組裝等生理過程。由于本身的低豐度、強親脂性和差抗原性，目前常規(guī)的檢測方法是放射性同位素標記法，但是存在耗時、價格昂貴、易產(chǎn)生有毒物質(zhì)等問題。另一種方法是采用疊氮肉豆蔻酸類似物對蛋白質(zhì)進行代謝標記，然后通過生物素偶聯(lián)的捕獲試劑富集。該方法的優(yōu)點是背景標記少，但是，由于高度混雜的脂肪酰化機制和脂肪酸代謝，特異性較差。因此，研究豆蔻酰化蛋白質(zhì)直接高效富集方法對于豆蔻酰化蛋白質(zhì)組學的鑒定具有很大的研究意義。

分子印跡是為模板分子量身定做的具有識別性能高聚物材料的合成技術，該法制備的分子印跡聚合物（Molecularly Imprinted Polymer，MIP）具有與目標分子形狀和功能基高度匹配的三維空穴，可實現(xiàn)對目標分子“鎖-鑰”模式的識別，是優(yōu)異的選擇性分離及純化手段。MIP具有選擇性強、穩(wěn)定性好、方法簡單等優(yōu)點，目前常用于固相微萃取、電化學傳感、色譜分離等領域。分子印跡技術大多采用非共價印跡法，即模板與功能單體間通過非共價鍵（氫鍵、離子鍵、配位鍵等）相互結合，該方法具有操作簡便的優(yōu)點，但存在選擇性差，容易產(chǎn)生非特異性吸附等問題，因此在蛋白組學的研究較少，發(fā)展相對緩慢。近來，針對蛋白質(zhì)翻譯后修飾發(fā)展了一些分子印跡新技術，如基于硼酸配體與順式二羥基化合物可逆結合的原理的硼親和分子印跡技術可實現(xiàn)對糖蛋白的特異性識別與富集；基于磷酸基團與金屬離子的親和力與分子印跡技術相結合，可以選擇性地對磷酸化蛋白質(zhì)及肽段進行富集與純化等，但這些方法難于用于豆蔻酰化肽的富集。

為了解決這一問題，本發(fā)明通過共價印跡法結合印跡后修飾方法為豆蔻酰化肽的特異性識別開辟一條新的途徑。

共價印跡法是指模板分子與功能單體以共價鍵的形式結合形成模板-功能單體復合物，該復合物在交聯(lián)劑的作用下連接到聚合物基質(zhì)上。例如，中國專利 CN201610480736. 2 利用共價印跡法，通過丹參素與丙烯醇的共價結合, 在交聯(lián)劑、引發(fā)劑、致孔劑的作用下制備丹參素的分子印跡聚合物，用于從丹參中選擇性地提取丹參素。目前，常見的共價鍵包括硼酸酯、席夫堿、縮醛（酮）等。其中，席夫堿是指由醛或酮與氨或胺縮合形成具有亞胺或甲亞胺特性基團（－C=N－）的一類有機化合物。迄今為止，尚無涉及基于合成席夫堿的共價印跡方法制備的豆蔻酰化四肽分子印跡整體柱的專利申請件。利用此原理制備印跡整體柱，可以提高對模板分子的選擇性，成功地解決了非共價印跡方法存在的非特性吸附問題，但是共價印跡方法存在模板-功能單體再結合困難的問題。