[發明專利]靶向敲除水稻粒型調控基因SLG7的方法、水稻粒型調控基因SLG7突變體及其應用

有效

• 申請號: 202110566843.8
• 申請日: 2021-05-24
• 公開（公告）號: CN113265422B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 梁國華;周楚婷;譚文琛;繆軍;周勇
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/113;C12N15/29;C12N15/66;A01H4/00;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 王玉

本發明公開了一種靶向敲除水稻粒型調控基因SLG7的方法、水稻粒型調控基因SLG7突變體及其應用，該方法采用CRISPR/Cas9基因編輯技術，選取水稻粒型調控基因SLG7的靶位點序列以及相應的上游引物和下游引物，先后構建中間載體和最終載體；將最終載體轉染到水稻愈傷組織中，獲得2種水稻粒型調控基因SLG7的突變體和相應的小粒型轉基因水稻植株，即完成水稻粒型調控基因SLG7的靶向敲除。該方法應用于短粒水稻品種的選育，可以免去雜交選育的工作，大大縮短短粒品種選育的周期。

技術領域

本發明屬于水稻基因分子育種領域，特別是靶向敲除水稻粒型調控基因SLG7的方法、水稻粒型調控基因SLG7突變體及其應用。

背景技術

水稻是世界上主要的糧食作物之一，全球近三分之二人口以水稻為主食，世界各地均有栽培水稻的歷史，是人類賴以生存，并且無法割舍的食物命脈。近年來，人們生活水平和消費水平不斷提高，水稻產量也不斷提高，科學家們將關注點放在了改善稻米品質上，尤其稻米的外觀品質。稻米的外觀品質主要包括粒型和堊白，改善稻米的粒型是科學家們不斷追求的育種目標。近年來，有關水稻粒形調控相關基因的克隆與功能研究已取得了長足的進展，從不同的水稻種質資源中已經分離出至少幾十個粒形相關基因或等位基因，分布在不同的染色體上，其遺傳機制和效應也大不相同。例如GS3、GLW7、GS9、GL6、GW2、GW5、GS5和GW8等。

SLG7(Slender?grain?on?chromosome?7)揚州大學梁國華教授團隊利用美國超長粒粳稻品種Azucena和我國秈稻骨干品種9311構建遺傳群體圖位克隆的一個水稻重要粒形基因，形態學和細胞學機制研究表明，來源于Azucena的基因SLG7通過縱向增加細胞長度橫向減少細胞寬度而產生纖細的顆粒，使谷粒變得細長，外觀品質更好(Yong?Zhou，etal.Natural?variations?in?SLG7?regulate?grain?shape?in?rice.Genetics，2015，201：1591–1599)?；騍LG7編碼了一個由941氨基酸組成的未知蛋白，與擬南芥中的LONGIFOLIA蛋白同源。進一步研究表明，該基因通過縱向增加細胞長度，橫向減少細胞寬度而產生細粒。

CRISPR/Cas9系統是探究基因分子的生物學功能和分子互作機制的一個精準、高效的技術手段，通過向導RNA與基因靶位點序列結合，在Cas9蛋白的作用下對靶DNA分子進行剪切，DNA分子發生斷裂后自動修復，在修復的過程中出現堿基插入、缺失或替換，導致翻譯提前終止，最終使原有的基因喪失功能。

過去，水稻育種主要通過雜交和回交的方法將粒型基因導入到其它的水稻品種中，這個方法獲得不同粒型的水稻株系的周期較長、工作量大、成本高。通過CRISPR/Cas9基因編輯系統直接對水稻的基因SLG7進行定點突變，創制不同粒型水稻株系，可以大大的縮短水稻育種的周期，目前，尚未有人針對水稻的基因SLG7，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對水稻粒型進行研究。

發明內容

針對以上現有技術的不足，本發明提供了一種靶向敲除水稻粒型調控基因SLG7的方法、水稻粒型調控基因SLG7突變體，以及創制新的水稻粒型的應用方法，可利用CRISPR/Cas9基因編輯技術簡便、快速、高效的得到小粒粒型的粳稻品種，為不同粒形性狀的水稻新種質創制提供一種快速、高效地分子育種方式，具體通過以下技術實現。

靶向敲除水稻粒型調控基因SLG7的方法，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術，選取水稻粒型調控基因SLG7的靶位點序列以及相應的上游引物和下游引物，先后構建中間載體和最終載體；將最終載體轉染到水稻愈傷組織中，獲得水稻粒型調控基因SLG7的突變體和相應的轉基因水稻植株，即完成水稻粒型調控基因SLG7的靶向敲除；

所述靶位點序列為水稻粒型調控基因SLG7的第三外顯子起始密碼子的第609-628堿基序列的片段，所述靶位點序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。