[發明專利]靶向敲除水稻粒型調控基因SLG7的方法、水稻粒型調控基因SLG7突變體及其應用

有效

• 申請號: 202110566843.8
• 申請日: 2021-05-24
• 公開（公告）號: CN113265422B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 梁國華;周楚婷;譚文琛;繆軍;周勇
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/113;C12N15/29;C12N15/66;A01H4/00;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 王玉

1.靶向敲除水稻粒型調控基因SLG7的方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術，選取水稻粒型調控基因SLG7的靶位點序列以及相應的上游引物和下游引物，先后構建中間載體和最終載體；將最終載體轉染到水稻愈傷組織中，獲得水稻粒型調控基因SLG7的突變體和相應的轉基因水稻植株，即完成水稻粒型調控基因SLG7的靶向敲除；

所述靶位點序列為水稻粒型調控基因SLG7的第三外顯子起始密碼子的第609-628堿基序列的片段，所述靶位點序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；

具體包括以下步驟：

S1、選取SLG7基因的靶位點序列；以SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列作為上游引物的核苷酸序列，以SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列作為下游引物的核苷酸序列；

S2、選取SK-gRNA用限制性內切酶AarI酶切形成帶有粘性末端的載體；將步驟S1的上游引物和下游引物混合后變性退火，形成帶有粘性末端的片段，將所述載體和片段進行連接，轉染大腸桿菌DH5α感受態細胞，得到中間載體；

S3、選取pC1300-Cas9載體用限制性內切酶Kpn?I和BamH?I進行酶切，將步驟S2所得中間載體用限制性內切酶Kpn?I和Bgl?II進行酶切并回收片段，將所得片段連接到pC1300-Cas9載體上，獲得含有所述靶位點序列的最終載體；

S4、將步驟S3獲得的最終載體轉化根癌農桿菌EHA105感受態細胞，并侵染水稻的愈傷組織，再生獲得轉基因水稻植株；

水稻粒型調控基因SLG7的突變體為slg7-1或slg7-2；所述slg7-1的第三外顯子起始密碼子的第626-627位的2個堿基缺失，所述slg7-1的第三外顯子的核苷酸序列如SEQ?IDNO.6所示；所述slg7-2的第三外顯子起始密碼子的第622-625位的4個堿基的缺失，所述slg7-2的第三外顯子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。

2.權利要求1所述的方法在調控水稻粒型上的應用。

3.根據權利要求2所述在調控水稻粒型上的應用，其特征在于，包括以下步驟：

P1、選用含有所述靶位點序列的最終載體，轉染根癌農桿菌EHA105感受態細胞，再進一步轉染到水稻的愈傷組織中，通過潮霉素篩選，再生獲得轉基因水稻植株；

P2、利用SLG7測序-F特異引物和SLG7測序-R特異引物，擴增步驟P1獲得的轉基因水稻植株的基因組片段，測序，篩選水稻突變植株；

所述SLG7測序-F特異引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；所述SLG7測序-R特異引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示；

P3、對步驟P2篩選出的各水稻突變植株進行粒型考察，獲得粒型改變的水稻突變株，繁殖得到粒型改變的水稻突變株系，即完成水稻粒型調控。