[發明專利]測序方法

在審

• 申請號: 202110566022.4
• 申請日: 2021-05-24
• 公開（公告）號: CN113293205A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 劉磊;駱瑋瑋;樊濟才;陸永藝;陳方;孫雷
• 申請（專利權）人: 深圳市真邁生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6874
• 分類號: C12Q1/6874
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種測序方法，該方法包括提供表面連接有多個單鏈核酸的固相基底，單鏈核酸的5'末端與該表面連接，單鏈核酸為包含插入片段?第一序列的多核苷酸，插入片段為來自待測樣本的核酸序列，第一序列為包含標簽?第一位點的預設序列，標簽為特異性對應待測樣本的預設序列；提供第一測序引物，該第一測序引物能夠與第一位點的5'末端雜交；以及使第一測序引物與單鏈核酸雜交并置于適于進行聚合測序的條件下，以通過延伸第一測序引物對單鏈核酸的一部分序列進行測定，獲得測序結果。該多重測序方法能夠有效地降低標簽跳躍的水平，特別適于需準確檢測混合樣本中的微量物種或稀有變異的情形。

技術領域

本發明涉及核酸檢測領域，特別地，涉及測序領域，更特別地，涉及一種適用于對標簽文庫進行測序的方法、一種試劑盒以及一種系統。

背景技術

下一代測序，也稱為高通量測序或者大規模平行測序，能夠在一次測序運行中測定多個樣本的核酸序列。實現這種測定的方法之一是通過多重樣本分析，多重樣本分析通常也稱為多重文庫(multiplex library)或者多重測序(multiplex sequencing)。

進行多重測序，會在文庫構建的過程中給每個DNA片段添加一段與該DNA片段來自的樣本唯一對應的特異性序列，使得多個樣本的文庫可以混合于一個反應體系中進行測序獲得測序數據，進而根據該特異性序列可將測序數據分配至相應的樣本，從而獲得每個樣本的測序數據，這里的特異性序列通常稱為標簽或索引(index，barcode或者tag)。

多重文庫之間的標簽分配錯誤，也稱為標簽跳躍(index hopping或者indexmisassignment或者sample cross-talk)，是多重測序已知的問題。

Kircher等人較早發現了這個問題，并提出了解決方案。他們設計了雙端雙標簽(double-indexing)試驗，通過在文庫兩端的接頭都引入標簽來定量檢測index hopping水平，發現在多重測序中，標簽分配錯誤率約為0.3％，比預期的高幾個數量級；同時，Kircher等人進一步披露了他們設計的該雙端雙標簽方法通過兩端的兩標簽交叉驗證來鑒定一個樣本，能夠使標簽分配錯誤率呈指數下降，顯著降低index hopping水平(Kircher等,2012,Nucleic Acids Res.,Vol.40,No.1)。

而后，隨著高通量測序技術的發展，特別是采用在圖案化流動池(patterned flowcell)上利用ExAmp技術(exclusion amplification，排他性擴增)擴增待測核酸獲得分子簇的測序平臺，index hopping問題更是凸顯。為此，Illumina公司提出了一種雙端雙標簽文庫策略(prepare dual Indexed libraries with unique Indexes)，在文庫的P5和P7端帶上獨特的標簽(UDI，Unique dual Index)，通過P5 Index 2和P7 Index 1成組設計，兩端index交叉驗證，從而解決該些測序平臺凸顯的index hopping問題(Illumina，2017，Effects of Index Misassignment on Multiplexing and Downstream Analysis WhitePaper)。

可以理解地，但凡涉及到利用高通量測序在一個高背景噪音干擾的混合物中尋求微量“陽性”數據的檢測都非常容易受到index hopping的影響，包括癌癥基因組學和其它的需要精確檢測稀有變異的應用，如液體活檢等。

隨著測序平臺和測序應用的開發和發展，有必要進一步降低標簽跳躍或者提供另外的能降低標簽跳躍的方法供選擇。

發明內容

本發明實施方式旨在至少一定程度上解決現有技術中存在的技術問題之一或者至少提供一種實用的替代方案。為此，本發明實施方式提供一種測序方法。

需要說明的，本實施方式的測序方法是發明人基于以下測試總結和發現作出的：