[發(fā)明專利]一種基于滾環(huán)擴增產(chǎn)物自組裝DNA水凝膠的適配體傳感器及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110564302.1
• 申請日: 2021-05-24
• 公開（公告）號: CN113189323B
• 公開（公告）日: 2023-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐斐;郝麗玲;劉馨娜;彭開敏
• 申請（專利權(quán)）人: 上海理工大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/53;G01N33/68
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務(wù)所(普通合伙) 32228
• 代理人: 聶啟新

本發(fā)明公開了一種基于滾環(huán)擴增產(chǎn)物自組裝DNA水凝膠的適配體傳感器，所述適配體傳感器包括OTA適配體、目標物、SH?PEG功能化納米金、引物、核酸外切酶Ⅰ、鎖式探針、T4DNA連接酶和Phi29DNA聚合酶。本發(fā)明通過增加滾環(huán)擴增反應(yīng)鎖式探針DNA序列中的T堿基數(shù)量，將納米金直接組裝到DNA水凝膠中，而無需對納米金進行DNA序列修飾，為實現(xiàn)赭曲霉毒素A的現(xiàn)場及快速檢測提供諸多便利。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于滾環(huán)擴增產(chǎn)物自組裝DNA水凝膠的適配體傳感器及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

赭曲霉毒素A(OTA)是食品和農(nóng)產(chǎn)品中最常見的危害物質(zhì)之一，常存在于酒類、堅果、咖啡、谷類食品中。OTA是一種由曲霉和青霉所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有腎毒性、免疫毒性、致畸性和致癌性。食品中OTA的常見檢測方法有可視化生物傳感器檢測方法、熒光生物傳感器檢測方法、電化學生物傳感器檢測方法、高效液相色譜法(HPLC)、表面增強拉曼散射檢測(SERS)等。其中，可視化檢測以其最易實現(xiàn)肉眼檢測而被認為是最有前途的現(xiàn)場快速檢測方法之一。

DNA水凝膠是一種新興的以DNA為主的三維宏觀生物材料，DNA水凝膠以其宏觀可視化的特性而使其在可視化檢測領(lǐng)域具有極大的優(yōu)勢。目前已有基于DNA水凝膠的可視化檢測的報道，這些檢測方法多通過將DNA水凝膠的化學或物理變化轉(zhuǎn)化為光信號進而實現(xiàn)可視化檢測。首先將目標物適配體序列與其他序列一并組裝得到DNA水凝膠，在目標物存在時，目標物會與DNA水凝膠中的適配體序列結(jié)合而導致凝膠結(jié)構(gòu)塌陷。然而，這種根據(jù)目標物引起的DNA水凝膠結(jié)構(gòu)變化而設(shè)計的生物傳感器的信號變化來自于DNA水凝膠降解過程中釋放的信號分子中。因此，在這種檢測模式下，少量目標分子只能引起DNA水凝膠的微小變化，釋放的信號分子變化也十分微小，從而導致較高的檢測限，無法滿足赭曲霉毒素A的現(xiàn)場快速檢測。

滾環(huán)擴增技術(shù)是一種等溫信號放大技術(shù)，可在恒定溫度下，通過設(shè)計特定引物序列和環(huán)狀模板序列，在特定DNA聚合酶的作用下，對模板DNA進行等溫擴增，可得到由重復(fù)序列組成的長鏈DNA產(chǎn)物。而這種長鏈DNA產(chǎn)物可在一定條件性進行DNA自組裝，進而可形成滾環(huán)擴增產(chǎn)物自組裝的DNA水凝膠。可將適配體技術(shù)于滾環(huán)擴增信號放大技術(shù)相結(jié)合，通過設(shè)計滾環(huán)擴增反應(yīng)模板序列，利用適配體、引物和目標物之間的競爭性結(jié)合作用，可實現(xiàn)在目標物存在時，才會啟動滾環(huán)擴增反應(yīng)，進而得到DNA水凝膠。在這種檢測模式下，少量目標物存在時，即可引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)，進而得到滾環(huán)擴增產(chǎn)物自組裝DNA水凝膠，可實現(xiàn)對目標分子的高靈敏度檢測。

但目前，基于滾環(huán)擴增產(chǎn)物DNA水凝膠的可視化檢測中，需要對納米金進行DNA修飾，通過修飾在納米金表面的DNA與DNA水凝膠中DNA之間的堿基互補配對使納米金與DNA水凝膠相結(jié)合。上述納米金的DNA修飾和納米金表面DNA與水凝膠種DNA之間的結(jié)合為DNA水凝膠可視化檢測帶來諸多不便。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明申請人提供了一種基于滾環(huán)擴增產(chǎn)物自組裝DNA水凝膠的適配體傳感器及其應(yīng)用。本發(fā)明通過增加滾環(huán)擴增反應(yīng)鎖式探針DNA序列中的T堿基數(shù)量，將納米金直接組裝到DNA水凝膠中，而無需對納米金進行DNA序列修飾，為實現(xiàn)赭曲霉毒素A的現(xiàn)場及快速檢測提供諸多便利。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于滾環(huán)擴增產(chǎn)物自組裝DNA水凝膠的適配體傳感器，所述適配體傳感器包括OTA適配體、目標物、SH-PEG功能化納米金、引物、核酸外切酶Ⅰ、鎖式探針、T4?DNA連接酶和Phi29?DNA聚合酶；

所述OTA適配體序列如SEQ?No.1所示；

所述引物序列如SEQ?No.2所示；

所述鎖式探針序列如SEQ?No.3所示。

所述SH-PEG功能化納米金的制備方法為：