[發明專利]一種基于滾環擴增產物自組裝DNA水凝膠的適配體傳感器及其應用

有效

• 申請號: 202110564302.1
• 申請日: 2021-05-24
• 公開（公告）號: CN113189323B
• 公開（公告）日: 2023-09-15
• 發明（設計）人: 徐斐;郝麗玲;劉馨娜;彭開敏
• 申請（專利權）人: 上海理工大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/53;G01N33/68
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 聶啟新

1.一種基于滾環擴增產物自組裝DNA水凝膠的適配體傳感器，其特征在于，所述適配體傳感器包括OTA適配體、目標物、SH-PEG功能化納米金、引物、核酸外切酶Ⅰ、鎖式探針、T4DNA連接酶和Phi29?DNA聚合酶；

所述OTA適配體序列如SEQ?No.1所示；

所述引物序列如SEQ?No.2所示；

所述鎖式探針序列如SEQ?No.3所示；

所述適配體傳感器的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備SH-PEG功能化納米金；

(2)制備DNA水凝膠；

(3)將制備的SH-PEG功能化納米金加入到DNA水凝膠中得到AuNPs/DNA水凝膠；在90℃孵育30min，然后冷卻至室溫；

SH-PEG功能化納米金與DNA水凝膠的用量比例為：5mL?SH-PEG功能化納米金加入30μLDNA水凝膠體系中；

(4)將AuNPs/DNA水凝膠在2000rpm條件下離心10min，用UV-1800紫外分光光度計測定其在530nm處的吸光度。

2.根據權利要求1所述的適配體傳感器，其特征在于，所述SH-PEG功能化納米金的制備方法為：

(1)將0.5mL?1％的HAuCl₄·4H₂O水溶液加入50mL純水中，在攪拌下加熱至沸騰；

(2)向其中加入0.4mL?5％的檸檬酸鈉水溶液，保持沸騰30min，將制備得到的酒紅色溶液冷卻至室溫，避光保存于4℃備用；

(3)取5mL步驟(2)制備得到的酒紅色溶液，向其中加入0.25mL濃度為5×10^-5M的SH-PEG，在37℃下孵育12h，然后以10000rpm離心10min，棄去上清液，制得沉淀即為SH-PEG功能化納米金，將沉淀分散在30μL純水中備用。

3.根據權利要求2所述的適配體傳感器，其特征在于，步驟(1)中，1％HAuCl₄·4H₂O水溶液的配制方法為：將1gHAuCl₄·4H₂O溶解并定容于100mL純水中。

4.根據權利要求1所述的適配體傳感器，其特征在于，所述DNA水凝膠的制備方法為：

(1)將20μL?10^-5M?OTA適配體和20μL?10^-5M引物混合并在95℃下退火10min，后采用梯度降溫法進行雜交以獲得適配體-引物雜交復合物；

(2)向其中加入5μL核酸外切酶Ⅰ以酶解未結合的DNA單鏈，制備得到純化后的適配體-引物雜交復合物；

(3)取10.5μL步驟(2)所得純化后的適配體-引物雜交復合物，加入待測OTA濃度的目標物，再向其中加入10.5μL?10^-5M鎖式探針及1.0μL?T4?DNA連接酶混合均勻并在37℃下孵育45min；T4?DNA連接酶的酶活為5.0U/mL；

(4)隨后向其中加入6.4μL?10mM?dNTPs、2.0μL?10u/mL?Phi29DNA聚合酶，混合均勻后于37℃孵育2.5h，此后置于4℃孵育12h，對所得產物用純水洗滌2次后得到DNA水凝膠。

5.根據權利要求4所述的適配體傳感器，其特征在于，步驟(1)中，梯度降溫法進行雜交的條件為95℃反應10min，然后自然降溫至25℃；步驟(2)中，酶解的條件為37℃反應30min后，于80℃反應15min。

6.一種權利要求1所述基于滾環擴增產物自組裝DNA水凝膠的適配體傳感器的應用，其特征在于，所述適配體傳感器用于檢測赭曲霉毒素A。