[發明專利]一種全禽源H5N2亞型禽流感重組毒株、疫苗及其應用

有效

• 申請號: 202110564078.6
• 申請日: 2021-05-24
• 公開（公告）號: CN113025583B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 亓文寶;廖明;陳意群;張家豪;李波;黃錦瑜;李華楠
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/85;C12N15/44;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

1.一種全禽源H5N2亞型禽流感重組病毒，其特征在于，由高致病性H5N6亞型禽流感流行毒株改造后的HA基因與H5N2亞型禽流感病毒D7株的七個內部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS構成；所述改造后的HA基因序列如SEQ ID NO：9所示；所述D7株的七個內部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～3、5～8所示；所述H5N6亞型禽流感流行毒株為A/Duck/Guangdong/19123/2019。

2.權利要求1所述全禽源H5N2亞型禽流感重組病毒的制備方法，其特征在于，將高致病性H5N6亞型禽流感流行毒株改造后的HA基因與H5N2亞型禽流感病毒D7株的七個內部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS一起拯救出重組病毒，即得。

3.根據權利要求2所述制備方法，其特征在于，所述方法包括構建分別表達H5N2亞型禽流感病毒D7株PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的7個質粒，構建表達SEQ ID NO：9所述序列的改造后HA基因的質粒，將上述8種質粒混合，并與轉染試劑一起加入到293T細胞中，拯救獲得H5N2亞型禽流感重組病毒。

4.根據權利要求2所述制備方法，其特征在于，所述方法具體包括如下步驟：

S1.構建H5N2亞型禽流感病毒D7株的八質粒反向遺傳操作系統，所述八質粒為分別包含H5N2亞型禽流感D7株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS 8個基因片段的重組質粒；所述D7株的八個基因PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～8所示；

S2.構建表達SEQ ID NO：9所述序列的改造后HA基因的質粒；

S3.將步驟S1中表達H5N2亞型禽流感病毒D7株PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的7個質粒與步驟S2中表達改造后HA基因的質粒混合，并與轉染試劑一起加入到293T細胞中，培養后獲得H5N2亞型禽流感重組病毒。

5.根據權利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟S1所述重組質粒為pSMC-PB2、pSMC-PB1、pSMC-PA、pSMC-HA、pSMC-NP、pSMC-NA、pSMC-M和pSMC-NS。

6.根據權利要求5所述制備方法，其特征在于，所述pSMC載體的構建方法為將pCI載體質粒上的BsmBI酶切位點去除，得到pCI-NEW，通過基因合成的方式得到轉錄啟動子序列、終止子序列以及轉錄元件；最后將載體pCI-NEW及獲得的轉錄元件分別用XhoI、MluI雙酶切后連接轉化，所獲得的重組質粒經過酶切鑒定和測序鑒定為陽性的質粒即為pSMC。

7.一種基于反向遺傳技術的重組全禽源H5N2亞型禽流感疫苗候選株，其特征在于，包括免疫量的權利要求1所述全禽源H5N2亞型禽流感重組病毒。

8.權利要求1所述全禽源H5N2亞型禽流感重組病毒、或權利要求7所述重組全禽源H5N2亞型禽流感疫苗候選株在制備預防H5N6亞型禽流感疫苗中的應用。