[發明專利]一種用于三種分子間結合作用解析的熒光三元相關光譜系統

有效

• 申請號: 202110563055.3
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113295662B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 董朝青;任吉存
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 河南大象律師事務所 41129
• 代理人: 王映樸

本發明公開了一種用于三種分子間結合作用解析的熒光三元相關光譜系統，熒光三元相關光譜系統包括至少三個輸出不同波長的激發光源，激發光源照明樣品激發產生的熒光信號，熒光信號根據熒光波長分成多路信號，通過單光子探測器探測，將信號傳輸至信號采集卡和運算卡，并進行三元相關函數實時運算，獲得熒光三元相關光譜曲線，本系統實現了熒光三元相關光譜通過對檢測微區內三種發射出不同波長的熒光分子熒光波動信號進行實時記錄和三元相關函數分析獲得熒光三元相關光譜曲線，解析曲線的振幅與三種熒光分子復合物濃度的關系，實現三種不同分子間共同結合作用的分析，將拓展熒光相關光譜在活細胞內原位分析研究。

技術領域

本發明涉及一種用于三種分子間結合作用解析的熒光三元相關光譜系統，屬于光譜分析領域。

背景技術

顯微成像和光譜分析技術由于具有的非侵入性、高檢測靈敏度等優勢成為目前生命科學研究中重要的研究工具，如光活化定位顯微鏡技術、隨機光學重構顯微鏡技術等。細胞內不同生物分子間通過不斷的兩兩相互作用和三元相互作用等，進行電子轉移、信號傳導、功能調控等，實現細胞的生理功能。細胞內異常的分子間相互作用的發生，如多蛋白的聚集作用是很多疾病發生的基礎，如克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)，并可能導致癌癥。目前發展的很多技術，包括酵母雙雜交法、親和純化-質譜分析法、免疫共沉淀法、蛋白質微陣列、超速離心分析法、表面等離子體共振分析和量熱法等可以實現對分子間相互作用的離線分析。但這些方法無法實現對活細胞內分子間作用進行原位分析。

熒光相關光譜是一類具有超高靈敏度的單分子光學檢測方法，是目前進行活細胞原位分析的重要工具，包括熒光自相關光譜(FACS)和熒光互相關光譜(FCCS)等。熒光自相關光譜系統通過對檢測微區(1fL)內的熒光分子由于布朗運動或者化學反應造成的熒光信號的漲落進行記錄，然后對熒光漲落信號進行自相關函數(Autocorrelation function，ACF)分析，得到熒光分子的熒光自相關光譜曲線，獲取其濃度、擴散系數、化學反應速率常數、結合和解離常數等信息。由于FACS作為一種單分子光學分析技術，具有非侵入性、靈敏度高、空間分辨率高等特點，因此被廣泛應用于在活細胞內進行測定。

熒光自相關光譜通過測定熒光分子或者熒光分子標記的生物分子的擴散系數的變化分析熒光分子或者熒光分子標記生物分子與其它分子間發生的結合作用。由于分子的擴散速率一般與分子的質量的立方根成反比，因此擴散系數的顯著變化必須要求熒光分子與其它分子結合后存在質量的非常顯著差異。同時，由于細胞內復雜的不均勻性、高擁擠性等特點，嚴重限制了熒光自相關光譜在活細胞內分子間相互作用的研究。

與熒光自相關光譜系統不同，熒光互相關光譜系統一般采用兩束同軸的激光束作為激發源，采用分光光路構建了兩個針對不同波長的熒光信號的檢測通道。通過對從兩個通道的熒光波動信號進行互相關函數(Cross-correlation function，CCF)分析，獲得熒光互相關光譜曲線。熒光互相關光譜常用于運動中的兩種不同的熒光分子間的相互作用分析。當兩種標記不同熒光發射波長的基團的分子由于布朗運動并發生結合作用時，那么兩個通道熒光信號的漲落呈現出同步性，在熒光互相關光譜分析中可獲得熒光互相關光譜曲線。發生相互作用的分子比例越高，熒光互相關光譜的振幅G(0)值越大。

對比于熒光自相關光譜，熒光互相關光譜對相互結合的兩分子間分子量差異沒有要求，因此顯著增加了對分子間相互作用分析的適用性，因此它已成為活細胞內研究分子間相互作用的重要工具之一。然而，在復雜的生命體系如細胞中很多生物功能的表達需要三種及三種以上生物分子間發生共同結合作用。熒光互相關光譜雖然可以實現分子間兩兩相互作用研究，但無法實現三種生物分子間共同結合作用的研究。

發明內容

本發明的研究目的是提供一種用于三種分子間結合作用解析的熒光三元相關光譜系統，該系統可實現三種不同熒光團標記的分子間結合作用的實時原位分析，突破傳統的熒光相關光譜無法用于三種分子間結合作用實時解析的限制。