[發(fā)明專利]一種從牛奶中提取細胞外囊泡的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110560726.0
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113215079B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 關(guān)瑞禮;譚曉輝;方冬;李學松;周利群
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學第一醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N15/87;A61K47/46
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11250
• 代理人: 安志嬌

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從牛奶中提取細胞外囊泡的方法。本發(fā)明提供一種從牛奶中提取細胞外囊泡的方法，包括：乳清中加入硫酸銨的步驟。本發(fā)明從牛奶中提取細胞外囊泡的方法，具有如下優(yōu)點：首次驗證硫酸銨可以用于mEVs的沉淀，且重新溶解后mEVs仍具有活性；該方法能夠提高mEVs的產(chǎn)量，純度相當，且成本更低，可以用于大規(guī)模生產(chǎn)mEVs；未來mEVs可以作為天然的納米載體，遞送蛋白質(zhì)、藥物及功能性RNA等生物活性分子，調(diào)節(jié)細胞的功能，治療疾病，具有很大的臨床轉(zhuǎn)化前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從牛奶中提取細胞外囊泡的方法。

背景技術(shù)

細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由細胞主動向外分泌的具有雙層膜結(jié)構(gòu)和生物活性的納米球狀物質(zhì)，主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)組成。其主要類型包括：外泌體(exosomes，粒徑30-150nm)、微囊泡(microvesicles，粒徑100-1000nm)、凋亡小體(apoptotic bodies，粒徑1000nm)。EVs的特點是分子結(jié)構(gòu)小，生物相容性高，可用于運輸脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA及RNA等物質(zhì)，是天然的內(nèi)源性納米載體。EVs廣泛存在于生物體內(nèi)，包括植物，哺乳動物和人。原則上，所有的活細胞都會分泌EVs。目前主要從細胞培養(yǎng)基以及血液、尿液、腦脊髓液、乳汁、羊水和腹水等體液中提取EVs。EVs在細胞間的信息傳遞中起重要作用，參與體內(nèi)多種生理和病理過程，包括炎癥、組織穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)元溝通、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等。EVs具有多樣化的功能和廣泛臨床應(yīng)用前景，可用于疾病診斷、納米藥物遞送、靶向治療、免疫治療等。作為遞送藥物和功能性RNA的有效載體，EVs具有明顯的優(yōu)勢：廣闊而天然的來源、納米尺寸、含有可用于靶向治療的膜配體。目前臨床轉(zhuǎn)化EVs有很多困境，具體如下：產(chǎn)量問題，目前的大多數(shù)方法獲取的EVs產(chǎn)量較低，比如超速離心法；純度問題，許多方法會分離出和EVs大小類似的生物分子，造成潛在的污染；來源問題，盡管EVs來源廣泛，但是獲取同質(zhì)性更高的EVs比較困難；規(guī)模效益問題，在較低成本下獲取大量的EVs是臨床轉(zhuǎn)化的一個關(guān)鍵點。

牛奶來源的細胞外囊泡(bovine milk-derived extracellular vesicles，mEVs)在納米載體方面具有眾多優(yōu)勢。首先，牛奶作為日常飲食的一部分，天然的來源對人體具有較好的生物相容性，降低了臨床中出現(xiàn)免疫反應(yīng)的可能性。與細胞療法相比，mEVs更易儲存且安全性較高。其次，牛奶比細胞培養(yǎng)基更容易獲得且更有成本效益，能夠大規(guī)模生產(chǎn)，是納米藥物遞送的理想選擇。mEVs遞送藥物可以提高藥物的穩(wěn)定性，體內(nèi)循環(huán)周期長，具有藥物代謝動力學的優(yōu)勢。mEVs的磷脂雙分子膜具有膜蛋白和靶向配體，比如CD47、CD63、組織相容性復(fù)合物Ⅰ/Ⅰ類分子等。更重要的是，mEVs可以保護內(nèi)容物免受胃腸道中酸性物質(zhì)和消化酶的侵害，這意味著口服mEVs是合理可行的。

目前，分離EVs的主流方法包括，超速離心法、尺寸排阻法、超濾法、免疫捕獲法、聚合物沉淀、以及非對稱流場流分離法等。其中，超速離心法所需儀器昂貴，回收率低，會分離出粒徑類似的雜質(zhì)，對EVs有潛在的損害。尺寸排阻法一種將溶液中的分子按其大小(在某些情況下為分子量)分開的色譜法，但是產(chǎn)量及效率較低，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。超濾法可以根據(jù)粒徑或分子量大小快速分離EVs，但是納米孔徑的超濾膜可能影響最終的EVs提取效率。免疫捕獲法利用特異性抗體識別EVs表面的標志物來分離EVs，特異性高，但是價格昂貴且不適合處理大體積樣本，而且容易丟失抗原表達偏低的EVs。聚合物沉淀法產(chǎn)量高，但是產(chǎn)物中存在大量蛋白質(zhì)雜質(zhì)，所需時間較長。非對稱流場流分離法是基于層流效應(yīng)的分離方法，主要缺點是可重復(fù)性差，效率低。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的分離EVs產(chǎn)量低、效率低、成本高缺陷，從而提供一種從牛奶中提取細胞外囊泡的方法。

一種從牛奶中提取細胞外囊泡的方法，包括：乳清中加入硫酸銨的步驟。

可選的，乳清中加入硫酸銨所得溶液中硫酸銨飽和度為2％-90％；